AhR活化对结肠炎性损害的缓解作用及机制研究

摘要

背景及目的：炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD），包括溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis，UC)和克罗恩病(Crohn's disease，CD)，是一种慢性肠道特发性疾病。大量研究表明遗传、环境及免疫因素均与IBD相关。其中，免疫调节紊乱目前被认为是IBD发病的主要病因，但其发病机制仍未研究透彻。肠粘膜屏障(Intestinal mucosal barrier，IMB)包括机械屏障、免疫屏障、生物屏障及化学屏障，是肠上皮抵抗外源物质的重要屏障。肠粘膜机械屏障由肠上皮细胞（Intestinal epithelial cell，IEC）及细胞之间的紧密连接(Tight junction，TJ)构成。其中，TJ起着重要的作用。研究表明，肠道炎症与TJ之间有着密切的关系。IBD患者的肠道紧密连接严重破坏，肠道通透性明显增加。另外，肠道紧密连接屏障的破坏会导致肠腔内有毒分子的渗透，诱导粘膜免疫系统和炎症反应，引发肠道疾病甚至全身系统性疾病如全身炎症反应综合征(Systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS)及多器官功能衰竭(Mutiply organ failure，MOF)。因此，目前认为有效的抑制炎症及维持肠粘膜屏障功能是目前治疗IBD的主要策略。
　　芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor，AhR），是一种广泛表达于机体各种细胞的转录因子。AhR通过与配体结合活化的方式入核，与AhR核转录子(AhR nucleartranslocator，ARNT)形成异源二聚体，特异性结合于AhR反应原件，诱导包括细胞色素酶4501A1（Cytochrome P4501A1，CYP1A1）等一系列下游基因的表达。6-甲酰基吲哚并[3，2-B]咔(6-formylindolo(3，2-b) carbazole，FICZ)是AhR的一种内源性配体，研究表明，FICZ可以通过活化AhR参与细胞生理功能的维持，包括调控细胞增殖、凋亡，抑制免疫反应等。
　　目前多项研究表明AhR活化可以抑制肠道炎症，但是其具体机制仍不清楚。另一方面，我们实验室的前期工作表明，AhR可以在肠梗阻模型中通过调节紧密连接蛋白的表达和定位缓解肠粘膜屏障功能异常。
　　因此，本课题通过模拟IBD动物模型及体外细胞模型，采用蛋白质免疫印迹(Westernblotting，WB)、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitation PCR，Real-timeQ-PCR)、免疫组化（Immunohistochemical，IHC）、免疫荧光(Immunofluorescence，IF)、跨膜电阻测量等技术，研究AhR活化减轻IBD肠道炎症及缓解肠粘膜屏障功能异常的具体机制。
　　方法：
　　1.建立小鼠DSS诱导的结肠炎模型，通过给予小鼠FICZ腹腔注射处理，用小鼠体重改变、结肠长度、死亡率、结肠形态学改变及炎症因子表达来评估小鼠肠道炎症的炎性损害情况。采用Western blotting、Real-time Q-PCR、IHC等技术检测CYP1A1、(tristetraprolin) TTP、ZO-1、claudin-1、occludin等的表达变化。使用Ussing Chamber检测小鼠结肠跨上皮电阻。观察AhR活化对结肠炎炎症及肠粘膜屏障功能的影响。
　　2.建立肠上皮细胞系LPS干预模型，通过给予FICZ处理、siRNA干扰AhR处理后，采用Western blotting、Real-time Q-PCR、IF等技术检测CYP1A1、TTP、MAPKAPK2、p-MAPKAPK2的表达，探讨AhR活化缓解结肠炎炎症的机制。
　　3.建立肠上皮细胞系TNF-α/IFN-γ干预模型，通过给予FICZ处理，用Westernblotting、Real-time Q-PCR、IF等技术检测CYP1A1、ZO-1、claudin-1、occludin等的表达变化，并检测细胞的跨上皮电阻(TER)，探讨AhR活化维持肠粘膜屏障功能的具体机制。
　　结果：
　　1.小鼠DSS模型中，相比于Sham组，DSS处理组小鼠体重明显降低，死亡率增加，结肠长度明显缩短，肠粘膜正常形态学改变（表现为炎症细胞浸润、上皮细胞融合脱落等）。小鼠结肠跨上皮电阻下降，肠粘膜通透性增加，肠粘膜屏障功能受损。而给予小鼠AhR激动剂FICZ后，同DSS组相比较，小鼠体重有所回升，死亡率降低，结肠长度明显增加，而肠粘膜损伤也有所缓解。小鼠结肠跨上皮电阻增加，肠粘膜屏障功能有所恢复。
　　2.小鼠DSS模型中，给予FICZ可以显著上调CYP1A1的表达，活化AhR。并且可以上调RNA结合蛋白TTP的表达。
　　3.体外LPS干预模型中，FICZ可以显著上调TTP表达。siRNA干扰AhR后，TTP表达有所下降，并且给予FICZ不能上调TTP的表达。另一方面，FICZ可以抑制MK2的磷酸化。siRNA干扰AhR后，FICZ不再能抑制MK2的磷酸化。
　　4.小鼠DSS模型中，DSS诱导的结肠炎结肠上皮中紧密连接蛋白如ZO-1、claudin-1、occludin的表达有下降。而给予FICZ处理后可以显著上调ZO-1、claudin-1、occludin的表达。
　　5.体外TNF-α/IFN-γ干预模型中，相比于TNF-α/IFN-γ处理组，给予FICZ可以上调细胞的跨上皮电阻，并且可以缓解ZO-1的结构破坏。另一方面，FICZ可以增加MLC的磷酸化。
　　结论：
　　1.FICZ在体内体外模型中均可以活化AhR。
　　2.AhR活化可以缓解DSS诱导的结肠炎炎症及肠粘膜屏障功能异常。
　　3.MK2/p-MK2/TTP通路参与了AhR调控肠道炎症的过程。
　　4.AhR活化可以减少炎症因子导致的肠上皮中紧密连接蛋白表达的下降及定位的改变。
　　5.MLCK/p-MLC通路可能参与了AhR调控紧密连接蛋白，缓解肠粘膜屏障功能异常的过程。

目录

声明

英文缩写

摘要

前言

第一章 AhR活化缓解IBD小鼠结肠炎模型并维持肠粘膜屏障功能

引言

材料与方法

结果

讨论

第二章 小鼠肠炎模型中FICZ对AhR活化及TTP调控的作用研究

材料与方法

结果

讨论

引言

材料与方法

结果

讨论

第四章 小鼠肠炎模型中AhR活化对上皮紧密连接的调控作用

材料与方法

结果

讨论

第五章 AhR活化调控上皮紧密连接的机制研究

材料与方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

文献综述1 炎症性肠病与芳香烃受体

文献综述2 紧密连接蛋白与炎症性肠病

攻读博士期间发表论文情况

致谢