红笛鲷重组激活基因克隆及表达分析

摘要

重组激活基因(recombination activating genes，rag)是脊椎动物特异性免疫反应的关键基因，是免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)和T细胞受体(T cellreceptor，TCR)进行V(D)J基因重组过程中必不可少的一部分，是脊椎动物进化分析的标记基因之一；该基因的表达能够用来监控淋巴细胞在免疫系统发育过程中的出现以及定位，是淋巴细胞正常发育和成熟的必要因子。
　　本论文以我国南方主要海水经济鱼类之一—红笛鲷(Lutjanus sanguineus)为研究对象，应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆了红笛鲷rag1和rag2 cDNA序列全长并对其进行了生物信息学分析。结果表明：rag1基因cDNA序列全长为3944bp，完整开放阅读框(open reading frame，ORF)为3183bp，5’非编码区(5’-UTR)为200 bp，3’非编码区(3’-UTR)为561bp，编码1060个氨基酸。预测分子量(MW)为120.5kDa，理论等电点(pI)为8.72。rag2基因cDNA序列全长为2200 bp，ORF为1602 bp，5'-UTR为141 bp，3'-UTR为457 bp，编码533个氨基酸。预测MW为59.6 kDa，理论pI为5.42。BLAST分析显示红笛鲷rag1和rag2基因所编码的氨基酸序列与其它已知物种相应基因编码的氨基酸序列最高同源性分别为82％和87％，多序列相似性比较表明RAG1和RAG2是高度保守的。构建的系统进化树分析显示，红笛鲷RAG1和RAG1分别与大西洋比目鱼(Hippoglossus hippoglossus)和红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)相应蛋白的亲缘关系较近。
　　以GAPDH和β-actin基因为内参，应用Real-time PCR技术，对灭活溶藻弧菌免疫前后，红笛鲷rag1和rag2在胸腺、头肾、脾脏、肝脏、心脏、肌肉、肠、脑等组织中的表达差异以及在上述组织中表达的时间差异进行了比较分析。结果发现，rag1和rag2的表达模式非常相似，在健康红笛鲷体内，rag1和rag2主要在胸腺、头肾和脾脏中表达，而经灭活溶藻弧菌免疫48h后，rag1和rag2 mRNA的表达量在所有组织中都发生上调。在实验时间段内，随着免疫时间的延长，rag1和rag2 mRNA的表达量在红笛鲷不同组织中达到峰值的时间不同：48h时胸腺中表达量达到峰值，60h时头肾、脾脏和脑中表达量均达到峰值，36h时肝脏中表达量达到峰值，而肠中则到96h时才达到峰值。
　　将红笛鲷rag1基因的一部分(编码554个氨基酸)和rag2全基因序列(编码533个氨基酸)分别亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)中，构建原核表达质粒pET28-RAG1和pET28-RAG2，经IPTG诱导后它们在E.coli BL21(DE3)中获得了大量表达。优化表达条件后，利用HisTrapTM HP亲和层析柱纯化了RAG1和RAG2融合蛋白。Western blot分析发现RAG1和RAG2融合蛋白均可与鼠抗His-Tag单克隆抗体发生特异性结合，表明目的蛋白得以成功表达。
　　利用纯化的RAG2融合蛋白，按照常规方法免疫新西兰大白兔，制备了兔抗RAG2多克隆抗体。ELISA检测显示，所获得的抗血清效价达到1:40000，Western blot显示该血清能与RAG2融合蛋白发生特异性免疫反应。为进一步研究RAG2在红笛鲷主要免疫器官的分布，应用制备的多克隆抗体对红笛鲷胸腺、头肾及脾脏组织进行了免疫组织化学分析。结果显示，RAG2主要分布于上述器官的淋巴细胞中。