草鱼IL-6的克隆及pcDNA-CiIL6、pcDNA-VP6与pcDNA-CiIL6-VP6的构建

摘要

草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国淡水养殖中重要品种之一，产量和产值均位居我国养殖鱼类前列。随着养殖密度的增加和养殖环境的恶化，草鱼养殖过程中病害频发，尤以病毒性出血病最为严重。该病发病急、流行范围广、传播快、死亡率高，且主要危害当年生和二龄的草鱼鱼苗，严重阻碍了草鱼养殖业的健康发展。草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus，GCRV)则是草鱼病毒性出血病的主要病原。白细胞介素（Interleukin，IL）是一类重要的细胞因子，它参与细胞间的相互作用，能够扩大和调节多种免疫应答，还可作为分子免疫佐剂，增强传统疫苗和新型疫苗的免疫效果。
　　本研究通过同源性克隆和Smart-RACE PCR技术克隆出草鱼白细胞介素6（Ctenopharyngodon idella interleukin-6，CiIL-6）基因的cDNA序列，并对其进行了生物信息学分析。结果表明CiIL-6基因cDNA序列全长为1145bp，包含一个长为702bp的开放阅读框，能编码233个氨基酸残基，软件预测其分子量为26.74kDa，理论等电点为8.27。氨基酸同源性分析显示，草鱼和斑马鱼(Danio rerio)IL-6基因的亲缘关系最近，它们的氨基酸同源性高达到76％，而与其他物种的同源性都低于30%。RT-PCR技术的结果显示CiIL-6在健康草鱼的胸腺、头肾和脾脏表达最高，而在鳃、胃和心脏中的表达量最低。随后把 CiIL-6去除信号肽后的片段定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中，转化BL21用IPTG进行诱导，CiIL-6在大肠杆菌中能高效表达相应蛋白。此外，我们将CiIL-6定向克隆至真核表达载体pDsRed2-N1中，通过脂质体转染草鱼CIK细胞，结果表明，CiIL-6主要定位在细胞质中。
　　GCRV的外壳蛋白中，以VP6的中和效价最高，是主要的中和抗原。本研究通过PCR技术扩增出GCRV的VP6基因，应用重叠延伸剪切技术将CiIL-6和VP6两个基因融合，该融合基因全长1998 bp，编码665个氨基酸，其分子量为75.44 kDa。本研究以真核表达质粒pcDNA3.1(+)为载体，分别构建了含CiIL-6、VP6和CiIL-VP6的核酸疫苗，并用脂质体将这些核酸疫苗转染了草鱼CIK细胞，结果显示，以上核酸疫苗都能在CIK细胞中高效表达，为下一步研究奠定了坚实的基础。

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1 文献综述

1.1 草鱼

1.2 草鱼呼肠孤病毒的研究进展

1.3 鱼类免疫系统与细胞因子的研究

1.4 鱼类疫苗研究进展

1.5 本研究的目的和意义

2 CiIL-6基因的克隆及表达分析

2.1引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论

3 CiIL-6-VP6融合基因的构建

3.1引言

3.2 材料

3.3 方法

3.4 结果

3.5 讨论

4 CiIL-6的亚细胞定位及真核质粒的构建

4.1引言

4.2 材料

4.3 实验方法

4.4 结果与分析

4.5 讨论

5 结 论

参考文献

致谢

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