草鱼NEDD4结合蛋白基因1(N4BP1)的克隆及功能分析

摘要

草鱼是我国重要的淡水经济养殖鱼类，但是随着养殖密度的增加和养殖环境的恶化，草鱼养殖中病害频发，严重制约了其发展。其中草鱼出血病是一种危害较大的病毒性传染病，草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus，GCRV)则是引起该病的主要病原。多年来，科研人员已对GCRV的形态特征、病毒基因组及蛋白晶体结构、病毒蛋白功能、细胞敏感性等进行了分析与鉴定，然而对病毒感染过程中草鱼的免疫应答机制，以及宿主与病毒间相互作用的研究还相对比较薄弱。本论文以我国主要淡水养殖鱼类之一草鱼(ctenopharyngodon idellus)为研究对象，应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆得到了草鱼NEDD4结合蛋白基因1(NEDD4 binding protein1, N4BP1)，并命名为Ci N4BP1。该基因cDNA序列全长为1131 bp，5′非编码区（5′-UTR）为98 bp，3′非编码区（3′-UTR）为481 bp，开放阅读框（open reading frame，ORF）为552 bp，编码183个氨基酸。预测分子量（MW）为19.8kDa，理论等电点（pI）为9.13。氨基酸序列分析结果表明CiN4BP1所编码的氨基酸序列与稻田鱼(Oryzias latipes)相应基因编码的氨基酸序列最高同源性为76％，进化树表明与斑马鱼(Danio rerio)相应蛋白的亲缘关系较近。在健康草鱼体内，CiN4BP1头肾、胸腺、鳃、脾脏中表达量较高，而经草鱼呼肠孤病毒感染后，Ci N4BP1在头肾、胸腺、脑、脾脏、体肾、胃、肌肉和肝脏等组织中的表达量均有上调。进一步的荧光定量 PCR结果表明，GCRV感染后草鱼主要免疫器官（头肾、体肾、脾脏、肝脏）以及CIK细胞中Ci N4BP1的表达量均随着感染时间的延长逐渐升高。随后，我们构建了原核表达重组质粒pET-N4BP1，导入大肠杆菌 BL21进行诱导表达，并优化了最佳表达的温度、IPTG浓度及诱导时间，最终确定pET-N4BP1重组蛋白的最佳诱导表达条件为：37℃，0.06 mmol·L-1 IPTG，诱导4 h。为了研究Ci N4BP1的亚细胞定位及其在GCRV感染中的作用，我们构建了N4BP基因的真核表达载体pDsRed2-N4BP1，瞬时转染CIK细胞后用荧光显微镜进行观察，结果显示CiN4BP1在主要分布在细胞质中。在此基础上，我们用GCRV感染pDsRed2-N4BP1瞬时转染的CIK细胞，并在不同时间点收样检测GCRV主要结构蛋白的表达情况。结果发现，CiN4BP1过表达能够抑制GCRV主要结构基因VP6的转录。
　　以上研究结果表明，CiN4BP1在宿主抵御病毒侵染的过程中发挥了一定的作用，这将有助于阐明 GCRV感染及宿主与病毒相互作用的分子机制，为草鱼出血病的防治提供了新的策略和理论依据。

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1文献综述

1.1 鱼类泛素系统的研究概况

1.2 NEDD4 Binding protein的研究进展

1.3本研究的目的和意义

2 Ci N4BP1的克隆与表达分析

2.1 实验材料

2.2试验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

3 Ci N4BP1的差异表达研究

3.1实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4讨论

4 Ci N4BP1的亚细胞定位及其对GCRV主要结构基因转录的影响

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4讨论

5 结论

参考文献

致谢

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