马氏珠母贝珍珠质形成microRNA的筛选和功能研究

摘要

本研究以马氏珠母贝珍珠囊转录组数据为基础，通过生物信息学分析对马氏珠母贝microRNA（miRNA）进行预测和筛选，构建马氏珠母贝miRNA数据库；并采用颈环引物荧光定量，mir-RACE验证miRNA基因的存在和序列的准确性。根据miRNA靶向调控功能基因的作用机制，以组织定量为依据，与软件分析结果相结合，筛选珍珠质形成相关miRNA，并分析其靶向调控基因，最后通过RNA干扰结合扫描电镜和荧光定量验证珍珠质形成相关miRNA的功能及可能的靶向调控基因。结果小结如下：
　　1、利用生物信息学分析方法，对马氏珠母贝转录组序列进行分析，共筛选出149条miRNA序列，其中与同源序列错配碱基数为3和4的序列，占总数的79％。miR-133前体的保守性较高。本物种microRNA与脊索动物和无脊椎动物都存在同源性。
　　2、本研究对miR-133、miR-2305和let-7e进行克隆验证，miR-133和miR-2305与预测结果相一致，let-7e的3`末端比预测结果短3个碱基。同时利用颈环引物荧光定量技术检测了9个miRNA在外套膜、闭壳肌、肝胰脏、鳃、性腺和足中的差异表达，结果显示在各个组织中均检测到这9个miRNA的表达，并且存在表达差异。
　　3、选取的10个与矿化结晶相关并已知3`UTR序列的基因，荧光定量显示nacrein、pearlin、pif177在外套膜中央区的表达量显著高于边缘区（p<0.05），确定三者参与珍珠质形成。通过靶向预测软件筛选出可能调控nacrein、pearlin、pif177的miRNA（miR-2418、let-7e、let-7、miR-2305、miR-15），颈环引物荧光定量显示这些miRNA在外套膜边缘区表达量显著高于中央膜（p<0.05）。暗示这些miRNA可能通过靶向调控珍珠质形成相关基因参与珍珠质形成，是珍珠质形成相关miRNA。
　　4、将筛选的珍珠质形成相关 miRNA在活体中过表达同时结合扫描电镜及荧光定量来验证它们对贝体珍珠层矿化的影响及可能的靶向调控基因。结果显示miR-2305和let-7e能导致实验贝珍珠层结晶的紊乱；并且let-7e的过表达能导致实验贝外套膜中央区pif177基因表达量的显著性下调（p<0.05）；miR-2305的过表达能导致pif177和pearlin基因表达的显著性下调（p<0.05）。研究结果证明miR-2305和let-7e参与贝壳珍珠质形成并对相关基因其调控作用。推测，let-7e通过靶向调控pif-177影响珍珠质的形成，miR-2305通过靶向调控pif177和pearlin影响珍珠质的形成。

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1前言

1.1珍珠贝矿化机制的研究

1.2 microRNA研究概况

1.3研究的目的和意义

2 马氏珠母贝microRNA的筛选

2.1 实验材料及方法

2.2实验方法

2.3结果与分析

2.4 讨论

3 马氏珠母贝microRNA序列的验证

3.1实验设计

3.2主要试剂、设备、及软件

3.3实验方法

3.4结果与分析

3.5讨论

4 珍珠质形成相关miRNA的筛选

4.1实验设计

4.2主要试剂、设备及软件

4.3实验方法

4.4结果与分析

4.5讨论

5 miR-2305和let-7e的功能研究

5.1实验设计

5.2试剂及设备

5.3 实验方法

5.4结果与分析

6 结论

1 马氏珠母贝miRNA的筛选

2 马氏珠母贝miRNA的验证

3 珍珠质形成miRNA的筛选

4 mir-2305和let-7e的功能研究

参考文献

附 录

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