哈维氏弧菌GST、GPx疫苗制备及其对斜带石斑鱼的免疫保护作用

摘要

哈维氏弧菌是一种栖息在水生和海洋环境的革兰氏阴性细菌,影响许多水产养殖动物。它是甲壳类动物和诱导养殖对虾发光弧菌病的病原体,它也是一种鱼类病原菌,感染多种物种,给海水养殖业带来严重的经济损失。目前,水产养殖控制弧菌病主要是依赖抗生素,但由此带来的各种副作用如细菌耐药性,环境污染相关联以及食品安全危害日益明显。近几年,人们转向了从基因工程方向来防治弧菌病。
　　生物体在代谢过程中会产生少量的自由基,体内的抗氧化系统(抗氧化剂和酶类)能及时清除从而维持自由基代谢平衡。在生物体内,常规生理浓度的活性氧(ROS)是维持正常细胞生理功能所需的,而过量的ROS则会对生物分子造成伤害。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽硫转移酶(GST)等组成了体内微型抗氧化系统,在维持生物体内活性氧(ROS)的平衡具有非常重要的作用,能有效保护细胞免受氧化损伤。
　　本研究通过同源引物从哈维氏弧菌ZJ0603基因组扩增得GST和GPx基因ORF,将两个基因分别克隆 pMD-18T载体测序,并进行生物信息学分析。GST基因 ORF全长615 bp,编码204个氨基酸组成的蛋白质。氨基酸序列经过Blast对比,该基因与Owensii弧菌、轮虫弧菌、坎贝尔弧菌的序列相似性分别为99％、99%、97%。GPx基因ORF除去信号肽全长477 bp,编码158个氨基酸组成的蛋白质。氨基酸序列经过Blast对比,该基因与Owensii弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌的序列相似性分别为99%、99%、97%。
　　将两个基因分别亚克隆到原核表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-GST和pET-GPx,且在大肠杆菌BL21(DE3)中获得大量表达。GST在37℃、4小时、IPTG浓度0.08 mmol/L表达量达到最高;而GPx在37℃、6小时、IPTG浓度0.1mmol/L表达量达到最高。通过镍亲和层析分离纯化GST、GPx蛋白,SDS-PAGE分析表明,纯化的蛋白为单一条带,分子量分别为28.2kDa和22.2kDa。
　　通过腹腔注射纯化的重组 GST、GPx蛋白免疫斜带石斑鱼,5周后用致病性V.harveyi进行人工感染试验,对斜带石斑鱼的免疫保护率分别为72.5%、77.5%;ELISA检测结果表明,所有试验组鱼都可检测到抗体,而且在第35d抗体达到峰值,表明这两个基因具有较好的免疫保护效应。
　　针对哈维氏弧菌 GST、GPx基因分别构建真核表达质粒 pcDNA-GST和pcDNA-GPx,并通过肌肉注射斜带石斑鱼。并通过从DNA水平和mRNA水平检测两种质粒在鱼体组织内的表达分布情况。结果显示:免疫接种后的7d和28d,注射点周边肌肉、肝、鳃、头肾和脾脏组织均有目的基因表达;ELISA和Western-blot结果表明,鱼血清内存在抗体,说明两种DNA疫苗免疫后鱼体表达了目的蛋白,并诱导产生了相应抗体。在攻毒试验中,重组质粒pcDNA-GST和pcDNA-GPx免疫保护率分别是80%和82.5%。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

1 前言

1.1 斜带石斑鱼

1.2 哈维氏弧菌研究进展

1.3 抗氧化系统与活性氧（ROS）

1.4 谷胱甘肽系统

1.5 研究目的及意义

2 GST、GPx基因的克隆、表达及条件优化

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4讨论

3 GST、GPx基因亚单位疫苗对斜带石斑鱼的免疫保护性研究

3.1 材料

3.2方法

3.3 结果

3.4 讨论

4 GST、GPx核酸疫苗对斜带石斑鱼的免疫保护性研究

4.1 实验材料

4.2实验方法

4.3 实验结果

4.4讨论

参考文献

致谢