凡纳滨对虾性腺抑制激素定位及激素对性腺发育基因表达的影响

摘要

性腺抑制激素(Gonad inhibiting hormone,GIH)是甲壳动物X器官窦腺复合体(XO-SG complexs)合成分泌的一种重要的神经多肽激素,对雌性和雄性的性腺发育起抑制作用。本文以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,利用 SMARTer RACE技术克隆GIH的5’UTR(包含部分ORF),利用生物信息学对GIH序列和结构进行了分析预测,通过免疫组化技术研究了GIH蛋白在眼柄中的表达和分布,用荧光定量PCR技术检测了雌激素对GIH及眼柄激素对其它性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,主要结果如下:
　　1.GIH基因的序列分析
　　凡纳滨对虾GIH cDNA序列由865个核苷酸组成,其中5’端非编码区(5’UTR)有56bp,3’UTR(包括poly(A))有521 bp,开放阅读框(ORF)有288bp,共编码96个氨基酸(包括17个氨基酸信号肽)。同源比对与进化关系显示,凡纳滨对虾GIH与斑节对虾GIH亲缘关系最近,同源性高达94％,与刀额新对虾同源性达63%,而与欧洲龙虾、美洲鳌虾、拟穴青蟹、青虾和鼠妇等甲壳动物GIH同源性均低于45%,与日本囊对虾、南美蓝对虾及中华绒螯蟹蜕皮抑制(MIH)同源性分别为77%、93%、89%。
　　凡纳滨对虾GIH蛋白分子量为11158.05Da,等电点为9.15;其中Leu(L)含量最高,达到了13.5%,Arg(R)含量为11.5%,Asn(N)含量为8.3%;GIH存在两种可能的跨膜结构,一种在从内到外第3-20位氨基酸α螺旋处,另一种在从外到内为第1-20位的氨基酸α螺旋处;前17个氨基酸为信号肽;GIH亚细胞77.8%主要定位在细胞外(包括细胞膜),11.1%存在于空泡中,11.1%存在于内质网中;用SWISS-MODLE在线软件预测凡纳滨对虾GIH成熟肽的3D结构,发现GIH预测蛋白由五段α螺旋,结构简单,与斑节对虾MIH结构类似。
　　2.GIH免疫组化分析
　　GIH分泌细胞主要定位在XO-SG,少量定位在神经轴索中。XO中GIH分泌细胞主要定位在端髓和内髓,SG中GIH分泌细胞定位在外髓,且XO和SG荧光强度相近。
　　3.雌二醇对GIH表达的影响
　　GIH的表达量随凡纳滨对虾卵巢发育逐渐降低;雌二醇抑制眼柄 GIH的表达,且分别与处理时间和浓度存在正相关。
　　4.摘除眼柄与注射眼柄提取物对生殖相关基因表达的影响
　　DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中组织表达。摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P<0.05),而注射眼柄激素后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P<0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG表达量显著增高,而注射眼柄激素后VASA和VTG表达量显著降低。
　　结果表明凡纳滨对虾GIH序列属于CHH家族II类多肽激素,与斑节对虾同源性最高,亲缘关系最近;GIH蛋白主要定位在XO-SG中,分散在端髓和外髓处,XO与SG荧光强度相近;17β-雌二醇对GIH存在负调控作用,并随处理时间和处理剂量GIH表达降低;眼柄粗提物可促进 DMC1但抑制VASA和VTG的表达。

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1前言

1.1甲壳动物眼柄神经内分泌系统概述

1.2眼柄中性腺抑制激素(GIH)的理化性质及分布

1.3外源激素对甲壳动物的生殖调控

1.4甲壳动物生殖相关基因

1.5本研究的目的

2凡纳滨对虾性腺抑制激素GIH 5’UTR的克隆及序列分析

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

3 GIH在凡纳滨对虾眼柄中的定位

3.1材料方法

3.2结果

3.3 讨论

4雌二醇（17β-E2）对凡纳滨对虾GIH表达的影响

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

5 摘除眼柄与注射眼柄激素对生殖相关基因的表达

5.1材料与方法

5.2实验结果

5.3讨论

6 结论

参考文献

致谢

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