来源于青霉F63的α-半乳糖苷酶的纯化、基因克隆、表达与性质研究

摘要

本研究利用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、分子筛层析和电泳技术从青霉F63中分离纯化到一种α-半乳糖苷酶Agl1，该酶的分子量为330kDa，亚基分子量为82kDa，该蛋白是由相同亚基组成的一种四聚体。经过MALDI-TOF-MS鉴定和ESI-MS/MS测序分析，该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。利用所测的两段内肽的氨基酸序列，设计简并引物，以青霉基因组DNA为模板PCR扩增得到了α-半乳糖苷酶的一段核苷酸序列。根据克隆到的α-半乳糖苷酶的核苷酸序列设计引物，通过反向PCR技术得到了该基因的5’上游和3’下游序列。根据该α-半乳糖苷酶的基因组序列，设计恰当的引物，以青霉F63菌丝体总RNA为模板，通过RT-PCR克隆到该α-半乳糖苷酶cDNA的全长序列。通过测序证明该α-半乳糖苷酶基因内部是没有内含子的。该α-半乳糖苷酶基因的开放阅读框架(ORF)为2205bp，GTG被推定为该基因的起始密码子，编码一个含有734个氨基酸的酶蛋白，N端21个氨基酸为该α-半乳糖苷酶的信号肽序列。推测该酶的理论分子量为78.5kDa，理论pI为5.07。在成熟蛋白的氨基酸序列中，有7个潜在的糖基化位点。与其它的α-半乳糖苷酶的氨基酸序列进行比较发现该α-半乳糖苷酶的氨基酸序列与黑曲霉的序列一致性最高，达到69.6％。该α-半乳糖苷酶与已知的青霉的α-半乳糖苷酶的氨基酸序列比较，发现它们的序列一致性较低，与紫青霉和单青霉的氨基酸序列一致性分别为7.5％和8.2％。这是首次从青霉属中克隆到糖基水解酶36家族的α-半乳糖苷酶基因。 将编码α-半乳糖苷酶成熟蛋白的序列克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中，电击转化宿主菌GS115，利用α-半乳糖苷酶底物(pNPG)平板筛选阳性转化子。从100个转化子中筛选到了23株表达α-半乳糖苷酶的重组子，其中56＃转化子在3L发酵罐水平表达量约为0.2mg/mL发酵液，α-半乳糖苷酶的酶活力达111U/mL，约为国外最高酶活力的2倍，是国内构建的α-半乳糖苷酶基因工程菌株的3倍。 将重组α-半乳糖苷酶和天然α-半乳糖苷酶进行纯化并进行了酶学性质的研究。天然酶的最适温度为45℃，重组酶的最适pH为40℃。天然酶与重组酶的最适pH都为5.0。重组酶与天然酶对高温都较敏感。天然酶在pH5.0-6.0之间具有良好的pH稳定性，而重组酶在pH6.0-6.5之间具有良好的pH稳定性，它们在常温作用12h后，剩余酶活力都大于88％。天然酶的比活为106.4U/mg，重组酶的比活为925.1U/mg。天然酶和重组酶都受Hg2+的强烈抑制，原始酶受Ag+的抑制不显著而重组酶受到Ag+的完全抑制。它们其它的酶学性质是相似的。重组α-半乳糖苷酶和天然α-半乳糖苷酶都可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖。重组α-半乳糖苷酶的比活性较高，最适温度与最适pH接近动物肠道的生理条件，故重组的α-半乳糖苷酶更有利于作为动物饲料添加剂。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章引言

第二章 一种来源于青霉的新的α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

第三章 α-半乳糖苷酶基因的克隆

第四章 α-半乳糖苷酶基因的异源表达

第五章 重组与天然α-半乳糖酶的酶学性质比较

第六章讨论

第七章结论

参考文献

致谢

作者简介