O型FMDV衣壳抗原的耐酸改造及其在昆虫细胞中的表达

摘要

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引发牛、羊、猪等偶蹄动物易感染的一种动物疫病，其传播速度快、感染率高，被世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties，OIE）列为必须上报的传染病，被我国列为一类动物传染病。接种疫苗是FMD防控最为有效的措施，在控制FMD暴发的过程中，FMD灭活疫苗起到了极为重要的作用，但其在生产的过程中需要大量增殖FMDV强毒，存在散毒的风险。据报道，FMDV空衣壳蛋白75S具有与完整FMDV146S粒子非常相似的抗原特性，可以引起与完整FMDV病毒粒子极其相似的免疫反应，而且病毒空衣壳不含核酸成分，安全性好，不存在散毒风险。因此，研制FMDV空衣壳疫苗显得极为重要。
　　为筛选与O型FMDV衣壳酸敏感性相关的位点，通过突变相关酸敏感性位点以提高衣壳蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac baculovirus expression system)中的表达量，以研制出基因亚单位疫苗。本研究以牛源O型FMDV ON株为研究对象开展耐酸性毒株的筛选工作，通过给予pH6.0酸性环境连续诱变，筛选获得6株耐酸性毒株。将诱变病毒与亲本病毒衣壳蛋白编码区P1区序列比对后在6株耐酸毒株P1区发现6个6株共有的核苷酸突变，即存在于VP3上的错义突变A460C和G462A(K154Q)及存在于VP1上的错义突变A121G(K41E)、A74G(Q25R)和A253G、A254C(N85A)。
　　然后以质粒pMD19-P12A3C为模板，扩增出编码O型FMDV衣壳蛋白前体P12A及其蛋白酶3C的P12A3C基因，插入至杆状病毒转移载体pFastBacDual PH启动子下，并做上述6个酸敏感性位点的突变，构建出重组转移载体pFastBacDual-P12A3C，然后将其转化DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞，构建重组转座子Bacmid-P12A3C，将其转染Sf9细胞，获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C。用其感染Sf9细胞以增殖重组杆状病毒，提取重组蛋白，然后通过间接免疫荧光、ELISA、western-blot检测外源蛋白的表达。结果表明，表达产物能够被O型FMDV多克隆抗体识别，并具有良好的反应原性，表明表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C构建成功。将提取的蛋白样品通过蔗糖密度梯度离心后用双抗夹心ELISA检测，结果在蔗糖密度约为35％的位置检测到较高的抗原表达量，与预期结果一致，免疫金标电镜观察在蛋白样品rBac-P12A3C中观察到了直径约27nm的正六边形颗粒，表明O型FMDV空衣壳在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中成功组装。本研究为后期研制出FMD的基因工程亚单位疫苗奠定基础。

目录

声明

摘要

英文缩写表

第一章 引言

1．1 研究背景

1．2 口蹄疫研究进展

1．3 口蹄疫病毒研究进展

1．3．1 口蹄疫病毒的基因组

1．3．2 口蹄疫病毒的血清型

1．3．3 口蹄疫病毒的抗原表位

1．3．4 蹄疫病毒的细胞受体

1．4 口蹄疫疫苗研究进展

1．4．1 传统疫苗

1．4．2 新型疫苗

1．5 口蹄疫的主要防控措施

1．6 Bac-to-Bac杆状病毒研究进展

第二章 O型FMDV的酸稳定性位点的筛选

2．1 材料与方法

2．1．1 病毒和细胞

2．1．2 菌株、载体及试剂

2．1．3 引物设计与合成

2．1．4 病毒的酸化培养

2．1．5 酸化病毒的噬斑筛选与培养

2．1．6 耐酸毒株和亲本病毒P1区的克隆测序与分析

2．2 结果

2．2．1 口蹄疫病毒的酸化培养

2．2．2 酸化毒的噬斑筛选

2．2．3 亲本病毒和耐酸毒株P1基因的扩增、克隆与鉴定

2．2．4 亲本病毒和耐酸毒株的序列比对

2．3 讨论

第三章 O型口蹄疫病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达

3．1 材料与方法

3．1．1 质粒和细胞

3．1．2 抗体及试剂

3．1．3 引物设计与合成

3．1．4 重组转移载体pFastBacDual-P12A3C的构建和定点突变

3．1．5 重组转座子Bacmid-P12A3C的构建

3．1．6 重组杆状病毒rBac-P12A3C的构建

3．1．7 间接免疫荧光(IFA)实验检测目的蛋白表达

3．1．8 重组蛋白的提取

3．1．9 重组蛋白的Western检测

3．1．10 重组蛋白的双抗体夹心ELISA检测

3．1．11 重组蛋白的蔗糖密度梯度离心及ELISA鉴定

3．1．12 病毒样颗粒的电镜观察

3．2 结果

3．2．1 P12A3C基因的克隆及鉴定

3．2．2 重组转移载体pFastBacDual-P12A3C的构建及鉴定

3．2．3 重组杆状病毒转座子Bacmid-P12A3C的构建与鉴定

3．2．4 重组杆状病毒rBac-P12A3C的构建

3．2．5 IFA检测外源基因的表达

3．2．6 目的蛋白的Western-blot检测

3．2．7 重组蛋白的双抗夹心ELISA检测

3．2．8 重组蛋白的蔗糖密度梯度离心及ELISA鉴定

3．2．9 病毒样颗粒的电镜观察结果

3．3 讨论

第四章 全文结论

参考文献

致谢

作者简介