基于蛋白组研究热应激影响肉鸡固有免疫的分子机制以及薄荷提取物的调节作用

摘要

为了阐明高温环境下肉鸡免疫机能下降的机制以及薄荷提取物的调节作用，本研究通过建立肉鸡免疫抑制的热应激模型，以脾脏为研究对象，应用iTRAQ定量蛋白组学技术，分析热应激下肉鸡脾脏总蛋白质的变化规律，结合生物信息学方法，对热应激引起免疫抑制的分子机制进行深入的研究，并研究薄荷提取物缓解热应激引起免疫抑制的机制。主要研究内容及结果如下: 1、肉鸡免疫抑制的热应激模型构建:96只28日龄的健康AA肉鸡随机分成两组，分别为对照组21℃和热应激组31℃，每个组48只鸡，每个组4个重复，每个重复12只鸡，相对湿度为60％，42日龄时试验结束，测定体核温度、呼吸频率和生产性能以及免疫机能。结果表明:热应激显著增加了肉鸡的体核温度和呼吸频率，显著降低了脾脏重量和脾脏指数，显著升高了血浆IL-2，IFN-α，IL-1β，IL-6和TNF-α的含量，显著降低了IFN-β的含量，导致免疫功能的下降，从而构建了肉鸡免疫抑制的热应激模型。 2、基于iTRAQ的肉鸡脾脏蛋白组学研究:42日龄时，对照组21℃和热应激组31℃每个重复各取3只鸡，进行屠宰取脾脏样品用于iTRAQ蛋白组学定量分析，利用基于质谱的PRM技术和RT-qPCR技术在蛋白质水平和mRNA水平上对固有免疫相关的差异表达蛋白质进行验证。结果表明:热应激导致IRF-3、CD40、TNFAIP3、IL-18、CathL2、IAP3、CYBA、TRIM25和POLR3F的下调，并且下调的差异表达蛋白质与Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、RIG-Ⅰ样受体信号通路和胞质DNA传感通路有关。 3、薄荷提取物对热应激引起的免疫抑制的调节作用:144只28日龄的健康AA肉鸡随机分成三组，分别为对照组21℃、热应激组31℃和热应激31℃+薄荷提取物组（添加量为300mg/kg），每个组48只鸡，每个组6个重复，每个重复8只鸡，相对湿度为60％，42日龄时试验结束。利用RT-qPCR对蛋白组学中筛选的固有免疫相关通路中的主要模式识别受体和转录因子进行检测，并采用ELISA法检测脾脏中的炎性细胞因子。结果表明:热应激显著增加了脾脏主要模式识别受体TLR2、TLR4和MDA5，NF-κB和MAPK通路中转录因子的mRNA表达量和炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，添加薄荷提取物后显著降低了脾脏主要模式识别受体NOD1和DAI，NF-κB和MAPK通路中转录因子的mRNA表达量和炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。 结论:1）揭示了热应激与Toll样受体信号通路(IRF-3和CD40)、NOD样受体信号通路（TNFAIP3、IL-18、CathL2、IRF-3、IAP3和CYBA）、RIG-Ⅰ样受体信号通路（TRIM25和IRF-3）、胞质DNA传感通路（IL-18、POLR3F和IRF-3）有关，并且热应激通过激活模式识别受体TLR2、TLR4和MDA5及其下游的NF-κB和AP-1通路而促进炎性因子的大量释放，最终导致免疫机能下降;2）揭示了薄荷提取物通过下调NF-κB和AP-1的表达，降低炎性细胞因子的释放缓解热应激引起的免疫机能下降。