利用琥珀正交系统拯救口蹄疫病毒的研究

摘要

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒引起的急性、热性、高度接触性传染的动物疫病。疫苗免疫是口蹄疫防控的主要措施。然而，常规疫苗常出现疫苗保护率不高、弱毒苗毒力返祖等现象而造成口蹄疫疾病的爆发。因此深入研究口蹄疫病毒的致病机制并制备保护率更佳、免疫效果更稳定的疫苗对口蹄疫的防控至关重要。 本研究借助正交系统在体外拯救口蹄疫病毒。首先构建pCMV-EGFP-Tyr40-TAG突变体琥珀抑制真核表达质粒和正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表达质粒，并共转染BHK-21细胞，通过G418和嘌呤霉素筛选、Western-blot鉴定，获得稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系，并鉴定该细胞系的稳定性。构建口蹄疫野生型质粒，分别构建表达VP1、VP2、VP3和3D蛋白的野生型质粒，并在不同位点引入TAG终止密码子获得VP1、VP2、VP3和3D蛋白的突变质粒，将野生型质粒和突变质粒分别转染稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA细胞系中，Western-blot鉴定，筛选出能够在稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA细胞系中表达目的蛋白的突变质粒，确定在口蹄疫病毒基因组上的TAG终止密码子的引入位点。根据突变位点筛选结果，利用点突变技术在口蹄疫病毒基因组上引入琥珀终止密码子(TAG)，获得口蹄疫突变质粒。将口蹄疫野生型质粒和突变质粒体外转录获得对应的mRNA，分别转染细胞40-48h后收样，细胞样品反复冻融三次进行传代培养。通过细胞病变情况、RT-PCR和测序结果表明，成功拯救出口蹄疫野生型病毒，为进一步利用正交系统拯救口蹄疫TAG突变病毒奠定了基础。本课题中所构建的口蹄疫突变病毒颗粒具有可控性，在引入特异正交系统的稳定表达细胞系中，能够包装出完整的口蹄疫病毒，而在正常哺乳动物细胞及动物体内无法增殖，该突变病毒的成功拯救为口蹄疫致病机制的研究及新型疫苗的研制提供一个新的思路和平台。该平台适用于所有可反向遗传操作的病毒。