Wnt/β--catenin信号通路在禽类干细胞向脂肪细胞分化中的作用

摘要

畜禽遗传资源是我国的宝贵财富，是畜牧行业相当重要的生产资料，遗传资源的保护与保存对于促进畜牧业的可持续发展，保证自然界物种多样性以及遗传多态性具有重要的意义，利用储存干细胞的方法保存遗传资源，也是为畜禽遗传资源的保护和利用开辟了新思路。本实验以禽类间充质干细胞为实验材料，对间充质干细胞进行了分离、培养及生物学特性分析和多向分化潜能的研究。畜禽的脂肪细胞分化过程是由间充质干细胞分化为前脂肪细胞，再分化为脂肪细胞。本文通过对Wnt/β-catenin信号通路在肉鸡脂肪干细胞向脂肪细胞诱导过程中的作用做了分析，得到以下结果: 1.利用Ⅰ型胶原酶分离肉鸡脂肪干细胞(ADSCs)，培养形态呈长梭形，是典型的间充质细胞的形态，在体外条件培养了28代。绘制P3、P15和P25肉鸡ADSCs的生长曲线检测其增殖的能力，共经历了潜伏期、对数期、稳定期以及衰亡期，呈典型的“S”形生长，随着代次的升高，细胞的增殖能力逐渐减弱。同样，细胞克隆形成能力实验结果表明，肉鸡ADSCs具有自我更新能力，但随着代次的增高，自我更新能力将会减弱。利用RT-PCR和免疫荧光检测细胞的表面标记物，再通过流式细胞仪分析其表面标记物的阳性率，表达率均在98％以上。在不同诱导条件下，肉鸡ADSCs具有多向分化能力，在体外条件下分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。 2.利用分散酶和胰蛋白酶分离获得鹅真皮间充质干细胞(DMSCs)，形态呈长梭形，在体外培养至21代。绘制P3、P12和P21鹅DMSCs生长曲线和细胞克隆形成能力，实验结果表明鹅DMSCs在低代次时具有强增殖能力与自我更新能力，随着代次的增高，其能力将会减弱。使用RT-PCR和免疫荧光检测细胞的表面标记物，再通过流式细胞仪分析其表面标记物的阳性率均在98％以上。在不同的诱导条件下，鹅DMSCs在体外条件下分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。 3.利用油红O染色及油红O提取法比对肉鸡ADSCs和鹅DMSCs的成脂分化能力，结果显示肉鸡ADSCs成脂分化能力大于鹅DMSCs;同时，因为由于鸡胚胎是经典的发育生物学的模型，且其在体外发育更易被研究，加之其基因组测序已完成，所以后续利用肉鸡ADSCs为实验材料探究Wnt/β-catenin信号通路在干细胞向脂肪细胞诱导分化过程中的作用。 4.利用激活剂在诱导条件下，激活Wnt/β-catenin信号通路，细胞中油红O染色的脂滴数目减少，脂肪转录因子C/EBPα和PPARγ的表达受到抑制。抑制Wnt/β-catenin信号通路，脂滴数目增多、体积增大，C/EBPα和PPARγ表达水平提高，促进了肉鸡ADSCs向脂肪细胞分化的潜能，表明Wnt/β-catenin信号通路在禽类干细胞向脂肪细胞分化过程中起到抑制作用。 综上所述，本实验已成功分离、培养肉鸡ADSCs和鹅DMSCs，这两种禽类间充质干细胞均具有自我更新的能力和多向分化的能力;通过激活和抑制Wnt/βcatenin信号通路，证明了该通路会抑制禽类脂肪干细胞向脂肪细胞分化的过程。