E3泛素连接酶RNF114通过泛素化降解NS4B蛋白抑制猪瘟病毒复制

摘要

猪瘟是一种猪的烈性传染病，其病原体猪瘟病毒(CSFV)属于黄病毒科瘟病毒属成员。蛋白质的泛素化修饰是一种重要而广泛的修饰过程，参与细胞内许多生理过程。宿主利用泛素化修饰抵抗病毒的感染，而病毒利用泛素化修饰介导免疫逃逸。目前，文献相继报道，蛋白质的泛素化修饰参与黄病毒科病毒的生命周期。前期，本实验室将表达萤火虫荧光素酶的报告病毒(rCSFV-Fluc)感染过表达猪源干扰素刺激基因(ISGs)的PK-15细胞系，筛选到E3泛素连接酶RNF114(ZNF313)为一种潜在的抗CSFV宿主分子，但其抗病毒机制尚不清楚。 本研究旨在证实猪源RNF114（pRNF114）的抗CSFV活性，并解析其抑制CSFV复制的分子机制。检测了CSFV感染过程中pRNF114的表达情况，结果表明，在CSFV-SM株感染猪的外周血单个核细胞（体内）以及CSFV感染的PK-15、肺泡巨噬细胞和外周血单个核细胞（体外）中，RNF114的mRNA水平随着CSFV感染时间、感染剂量的增加而上调，说明pRNF114参与调控CSFV的复制。在pRNF114抗病毒功能方面:将不同剂量（MOI=0.01和0.1）的rCSFV-Fluc或CSFV-SM株感染过表达pRNF114的PK-15细胞系(PK-pRNF14)，感染24和48h后，从荧光素酶活性、病毒滴度和基因组拷贝数3个方面评价CSFV的复制水平，结果表明，过表达pRNF114抑制CSFV的复制;相反，用CSFV感染敲除RNF114的PK-15细胞系(PK-RNF14-KO)，在感染后24和48h检测CSFV复制水平，结果表明，敲除内源性RNF114促进CSFV复制。过表达及敲除试验均证实，pRNF114是一种抗CSFV宿主分子。在pRNF114抗CSFV分子机制方面:首先，构建了pRNF114(C64/67A)突变体，并用体外泛素化试验证实，pRNF114(C64/67A)缺失E3泛素连接酶活性;CSFV感染PK-pRNF114(C64/67A)细胞系后，结果表明，pRNF114(C64/67A)不能抑制CSFV复制，说明pRNF114抑制CSFV复制依赖其E3泛素连接酶活性;其次，通过免疫共沉淀（Co-IP）筛选到pRNF114与CSFV NS4B蛋白存在直接的相互作用，且证实pRNF114通过蛋白酶体途径降解NS4B蛋白;最后，构建了不同位点赖氨酸突变的泛素突变体，证实pRNF114催化NS4B蛋白发生K27连接的聚泛素化修饰。 综上所述，证实，pRNF114是一种抗CSFV宿主分子;并阐明pRNF114抗CSFV复制的机制:pRNF114介导NS4B蛋白发生K27连接的聚泛素化修饰，促进NS4B蛋白经蛋白酶体途径降解，进而发挥抗CSFV作用。