日本血吸虫成虫体干细胞相关基因Sjp53的鉴定及生物学功能研究

摘要

日本血吸虫病是由日本血吸虫感染引起的慢性、消耗性人畜共患寄生虫疾病。日本血吸虫在宿主体内长期寄生，产生大量虫卵是造成宿主病理损伤的主要原因。日本血吸虫在宿主体内的长期寄生不仅与免疫逃避相关，而且与其在受到免疫攻击或其他损伤时，能够修复受损组织，保持组织结构完整性和维持自我稳定的能力不可分割。这种能力与成虫体干细胞密切相关。因此鉴定日本血吸虫成虫体干细胞并研究相关基因功能对探索血吸虫长期寄生的生理机制有重要意义。 1.日本血吸虫成虫体干细胞及其转录组的分析 日本血吸虫42d成虫用100Gy的γ射线辐照，在辐照后24、48h加入EdU孵育24h，荧光染色结果表明日本血吸虫体干中存在有增殖能力的干细胞。利用RNA-seq分析比较成虫体干细胞耗减前后的雄虫体干转录组差异，筛选到235个干细胞相关转录本，其中下调表达179个，上调表达56个，选取10个进行qPCR验证，表达趋势与结果相一致。GO分析表明下调基因主要集中于生物进程的生殖、发育和应激反应等生理过程，KOG和KEGG分析提示下调基因中有50个与细胞周期和DNA复制修复相关，28个参与通路的基因中有15个参与DNA复制通路。结果与日本血吸虫经辐照后成虫体干细胞耗减，虫体体干中不再有细胞增殖的生物现象相符。 2.日本血吸虫Sjp53的克隆表达及重组蛋白免疫保护效果评价 在转录组数据中筛选到一个与DNA复制修复相关，表达下降2倍的转录本，预测属于p53基因家族。应用PCR克隆到对应的CDS，该基因有2883bp的开放阅读框，编码960个氨基酸残基，具有p53功能结构域、4个蛋白结合位点和2个核酸结合位点，将该转录本命名为Sjp53。构建重组表达质粒pCold I-Sjp53，在BL21(DE3)大肠杆菌中可诱导表达并纯化得到约110kDa的不可溶性重组蛋白rSjp53。应用rSjp53结合206佐剂免疫BALB/c鼠，可诱导高水平的特异IgG抗体。免疫血清可识别rSjp53和日本血吸虫成虫蛋白中的相应条带，表明rSjp53具有良好的抗原性。在小鼠日本血吸虫病免疫保护试验中诱导了显著的肝脏减卵率。 3.Sjp53生物学功能研究 选取含Sjp53的功能结构域的片段，构建pXJ40-Sjp53d真核表达质粒，转染哺乳动物细胞，Western和免疫荧光结果表明，该蛋白可在真核细胞中表达。细胞增殖试验结果表明，Sjp53重组真核蛋白能够促进Vero和293T细胞增殖，抑制H1299和Hela细胞增殖。利用p53特异抑制剂处理虫体抑制内源性p53活性，虫体增殖细胞数量和细胞EdU结合量均明显降低，表明Sjp53可维持日本血吸虫成体干细胞正常增殖。在体外培养体系中加入H2O2后，qPCR结果显示Sjp53转录水平随刺激时间延长而不断升高，同时虫体活力没有明显变化，结果表明Sjp53具有抗氧化应激作用。紫外辐照处理后的Sjp53活性正常虫体比Sjp53活性抑制虫体的凋亡细胞数量明显增多，结果说明Sjp53可使DNA严重损伤细胞更倾向于凋亡。 综上，本文建立了日本血吸虫成虫体干细胞射线辐照模型，获得了成体干细胞的转录组数据，筛选到成体干细胞相关基因Sjp53。首次克隆了日本血吸虫Sjp53基因，在大肠杆菌和真核细胞中表达了重组蛋白，研究了Sjp53对细胞增殖的影响、应对氧化应激和DNA损伤的生物学功能。