我国不同基因亚型新发PRRSV的生物学特性分析及标记疫苗的研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是引起猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)的病原。九十年代初期，Ⅰ型和Ⅱ型PRRSV几乎同时在欧洲和北美出现。1996年，中国人陆首次分离到PRRSV。经过二十多年的演化，PRRSV的多样性更加复杂。 为了了解我国不同基因亚型新发PRRSV的流行情况和生物学特性，本研究在2014-2018年从全国14个省市疑似PRRSV感染的1900份病料中检测分离PRRSV。本研究共测定了321株PRRSV的ORF5基因和50株PRRSV的全基因组序列，鉴定了5种类型的PRRSV，分别是NADC30-1ike PRRSV(Sublineage1.8)、NADC34-1ike PRRSV(1-7-4,Sublineage1.5)、QYYZ-like PRRSV(Sublineage3.5)、RespPRRSV MLV like PRRSV(Sublineage5.1)和Sublineage8.7PRRSV,其中NADC34-1ike PRRSV是首次在中国发现。本章节主要完成了以下6个内容:(1)本研究根据Shi et al(2010)的报道，进一步将Lineage1PRRSV分为9个Sublineage(1.1-1.9)，NADC30-1ike PRRSV属于Sublineage1.8。Sublineage1.8PRRSV具有更快的变异速度和更高的重组频率，毒株之间的基因组同源性较低，重组模式复杂多样，重组的位置主要集中于非结构蛋白区和次要结构蛋白区。(2)2017年，本研究首次分离到2株Nsp2蛋白存在100个aa连续缺失的新毒株LNWK96和LNWK130，2株毒株均为重组病毒，遗传演化分析显示，该类毒株属于Sublineage1.5，它们与美国流行的NADC34毒株同源性最高，也被称为NADC34-1ike PRRSV或1-7-4分支PRRSV，它们可能起源于北美。(3)本研究对Lineage3PRRSV进一步分类，分为Sublineage3.1-3.5，Sublineage3.5PRRSV具有较高的重组频率，与本地毒株重组后广泛存在于我国的南方地区。通过对过度毒株FJ-1和FJFS的遗传演化分析，证实了大陆地区的Sublineage3.5PRRSV起源于台湾地区的Sublineage3.2。(4)Lineage5PRRSV疫苗在我国应用较早，我国分离的Lineage5PRRSV均属于Sublineage5.1，它们与ATCC VR2332和疫苗株RespPRRS MLV具有较高的核苷酸同源性。Sublineage5.1PRRSV在我国变异较小，这类毒株的出现可能和疫苗的应用有关。(5)本研究将Sublineage8.7PRRSV进一步分为Sublineage8.7.1(CH-1a like PRRSV)、Sublineage8.7.2(HP-PRRSV like PRRSV)和Sublineage8.7.3(HP-PRRSV)，2006年以后，HP-PRRSV席卷全国各省，然而，近年来Sublineage8.7.3PRRSV已经发生较大变异，这类毒株的致病性和当前疫苗的保护效果尚不清楚(6)Sublineage1.8PRRSV是我国新出现的PRRSV，而且在短时间内已经成为我国的主要流行毒株，本研究对Sublineage1.8PRRSV SD53-1603株进行了致病性和免疫保护效果评估，结果表明SD53-1603株对猪只具有中等致病性，当前商品化疫苗HuN4-F112可以提供一定程度的保护。 为了寻找PRRSV的遗传演化规律，本研究对相对封闭的大型养殖集团进行了长达4年的PRRSV监测，从该大型养殖集团的不同猪场共采集了338份疑似PRRSV感染的组织或血清，鉴定并测序了119株PRRSV的ORF5序列和34株PRRSV的全基因组序列。鉴定了4种类型的PRRSV存在于该大型养殖集团，分别是NADC30-1ike PRRSV(Sublineage1.8)、QYYZ-like PRRSV(Sublineage3.5)、RespPRRSV MLV like PRRSV(Sublineage5.1)和HP-PRRSV(Sublineag8.7)。发现当前如此复杂的重组模式是逐步形成的，同一毒株在不同的位置发生重组，增加重组的多样性，为病毒的生存提供更多的可能。该集团RespPRRS MLV like PRRSV是RespPRRS MLV疫苗的返强毒株，确定了5个毒力相关位点和4个返强相关位点。大型养殖集团内PRRSV的分布和传播与猪只的运输关系和疫苗的使用密切相关。 弱毒疫苗是防控PRRS的主要方法之一，但目前使用PRRS活疫苗的缺陷是疫苗株抗体不能与野毒株抗体有效区分，不利于疫苗免疫效果的评价和疫病的净化。为了解决这一难题，在本实验室已建立的针对M蛋白（IC8表位）的阻断ELISA抗体监测方法基础上，本研究构建了NADC30-1ike PRRSV SD53-1603株的感染性克隆，并成功拯救出子代病毒。运用该感染性克隆平台，构建了12种M蛋白1C8表位aa缺失或替换的缺陷型质粒，通过病毒拯救，成功获得5种缺失病毒。经过体外验证后，将这5种缺陷型病毒传至65代进行免疫实验，实验结果表明，rSD53-1603-A3SA4S-M65与母本毒株rSD53-1603-M65产生针对1C8表位的特异性抗体差异极显著，以上结果为PRRSV DIVA疫苗的研制奠定了基础。