基于免疫磁分离的金黄色葡萄球菌RPA--LF快速检测方法的建立

摘要

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SP)作为食源性致病菌在自然界中广泛存在，其易污染肉制品、蔬菜等食品。由于缺乏有效、快速和可视化的检测方法，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件时有发生。故亟需建立一种快速、灵敏可大批量应用的检测方法。目前，关于金黄色葡萄球菌的检测方法普遍存在周期较长，设备昂贵，不利于基层现场大批量检测等不足。免疫磁分离(Immunomagnetic separation，IMS)方法可显著浓缩目的细菌，降低食品基质和杂菌对于后期检测的干扰，提高检测效率。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)具有快速、便捷、高效和廉价等优点。本研究建立了一种基于免疫磁分离的金黄色葡萄球菌RPA-LF(Lateral flow,LF)快速检测技术，为金黄色葡萄球菌的检测提供新的技术方案。 为了制备可用于金黄色葡萄球菌检测的特异性单抗，本研究将甲醛灭活的4株不同来源的金黄色葡萄球菌(ATCC6538、ATCC29213、CMCC26003和SH001)等量混合物作为全菌免疫原，免疫BALB/c小鼠。采集小鼠脾细胞，与SP2/0细胞融合后，运用间接ELISA筛选效价高、特异性好的单细胞克隆，亚克隆后将细胞注入BALB/c小鼠腹腔，收集腹水。本研究共筛选出4株单克隆抗体(SP1、SP2、SP3和SP4)，其特异性良好，效价均较高，其中SP4抗体效价高于1∶5.12×106。4种抗体的轻链皆为Kappa型，SP2重链为IgG1型，SP1、SP3和SP4为IgG2型。竞争EILSA法结果显示，4种单克隆抗体间均不存在抗原表位交叉或覆盖。表明本研究制备的单克隆抗体特性良好，为后期金黄色葡萄球菌免疫磁珠分离法奠定了基础。 将单克隆抗体与羧基磁珠偶联可制备用于捕获细菌的免疫磁珠。为了优化免疫磁珠的使用条件，本研究开展了对4种偶联缓冲液、3种不同直径的磁珠和捕获时间的影响研究。结果表明，偶联缓冲液为MEST(0.025M，pH7.0)时，捕获效率最高，750nm为最佳磁珠直径，捕获时间在45min后，捕获率达到最高。特异性捕获实验表明，免疫磁珠对于金黄色葡萄球菌的捕获率在90％以上，而对于其它12种常见的食源性致病菌捕获率均在10％以下，表明本研究制备的金黄色葡萄球菌免疫磁珠捕获率高，特异性好。敏感性实验显示，捕获体系中细菌为102CFU时，免疫磁珠依然可以成功捕获。本研究制备的免疫磁珠特性良好，为后期食品基质中金黄色葡萄球菌的快速检测奠定了基础。 为了建立一种可在牛奶中快速检测SP的IMS-RPA-LF检测方法。本研究对RPA的引物、孵育温度和孵育时间进行优化，结果筛选出一对具有最佳检测效果的针对SP耐热核酸酶基因nuc的引物，其最佳孵育温度为39℃，最佳孵育时间为10min。特异性研究表明，RPA-LF与常见的12种食源性致病菌无交叉反应。敏感性检测结果表明，对金黄色葡萄球菌基因组的最低检测限为600fg。为了评价IMS-RPA-LF对实际样品的检测性能，本研究通过在牛奶中添加不同CFU的金黄色葡萄球菌，进行模拟检验。检测结果表明，当金黄色葡萄球菌浓度为7.5×102CFU/mL时，IMS-RPA-LF即可检出阳性。上述研究结果表明，本研究建立的基于免疫磁分离的金黄色葡萄球菌RPA-LF快速检测方法具有特异性高、检测时间短和检测灵敏度高等优点，为研制金黄色葡萄球菌的检测方法提供了参考。