利用转录组测序和蛋白质组学分析筛选绵羊多羔候选基因的研究

摘要

绵羊产羔数是一个极其复杂的性状，受遗传、表观修饰和激素等因素的调控，但多羔性状形成的分子遗传机理仍不明晰，迫切需要对其进行深入探究。本课题选择无FecB突变但同时具有单多羔性状分离的小尾寒羊母羊为研究对象，对繁殖表型进行追踪和测定，利用单细胞转录组测序(single cell transcriptome sequencing，scRNA-Seq)、卵巢RNA-Seq以及卵巢蛋白质组学分析策略筛选与绵羊多羔性状相关的差异基因和差异蛋白。 对实验羊群体实施同期发情，利用腹腔内窥镜观测排卵数，根据产羔数和排卵数将实验羊分为单羔组和多羔组。与单羔组相比，多羔组母羊成熟卵泡数量较多（P＜0.01），但平均直径缩小了1.62mm（P＜0.05）。利用公羊试情观察两组母羊的发情状态，采集血样检测一个完整情期内两组母羊血清中促卵泡素、促黄体素、孕酮、睾酮和雌二醇激素水平动态变化。结果表明，与单羔组相比，多羔组母羊的发情启动和发情终止分别提前了3.75h（P＞0.05）和7.2h(P＞0.05)，但发情持续期缩短了15.61％(P＜0.05);多羔组母羊血清中5种激素浓度变化差异不显著，但多羔组母羊黄体期血清中E2浓度提高了11.09％（P＞0.05）。 scRNA-Seq测序结果显示，在卵母细胞、卵丘颗粒细胞和卵泡膜比较组中分别筛选出415、395和507个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。KEGG富集分析发现氧化磷酸化和核糖体通路对卵母细胞成熟和卵泡膜细胞增殖发挥重要作用;缬氨酸-亮氨酸和异亮氨酸代谢通路与颗粒细胞增殖和功能有关。ATP5H、COX7A1、QCR10、GDF9和BCAT2等10个DEGs可能与卵母细胞发育和排卵数有关。lncRNA与mRNA互作表明，MSTRG.230597、MSTRG.291734、MSTRG.1541、ENSOARG00000026777等多个差异lncRNAs通过靶基因在能量代谢、蛋白质合成过程中发挥重要调控作用。 利用卵巢RNA-Seq分别在卵泡期和黄体期多羔与单羔比较组（PFO/MFO和PLO/MLO）中筛选出458个和506个DEGs。KEGG富集分析发现氧化磷酸化、核糖体、卵巢类固醇激素合成等通路与卵巢生理功能和卵泡发育有关，其中HYAL2、STAR、GDF5、CYP19A1和CD81等10个DEGs与绵羊卵巢功能有关，影响母羊排卵和产羔数。lncRNAs与mRNAs互作表明，MSTRG.41242、MSTRG.99308等多个差异lncRNAs可能通过靶基因在各自通路中发挥重要的调控作用。 卵巢蛋白质组学分析共鉴定到5074种蛋白质，其中在黄体期卵巢和卵泡期卵巢比较组中分别有101种和57种差异蛋白。KEGG富集分析发现氧化磷酸化、卵巢类固醇激素合成、牛磺酸和亚硫磺酸代谢和凋亡通路等被显著富集，参与卵巢功能调控，涉及到COX7A、HYAL2、AIFM1和StAR等9个差异丰度蛋白可能对母羊的多羔性能起调控作用。 对转录组和蛋白组进行联合分析发现氧化磷酸化、核糖体和卵巢类固醇激素合成3条通路对卵巢功能和卵泡发育发挥重要作用，可能与无FecB突变的小尾寒羊的多羔性状相关，可以作为绵羊多羔性状形成的关键候选通路。其巾涉及的STAR、HYAL2、COX7A1、QCR10、GDF9、CD81和A1FM1等基因可以作为与多羔性状相关的关键候选基因。以上研究结果还需进行进一步的功能验证。本文研究结果可为揭示绵羊多羔性状形成的分子遗传机理和分子设计育种提供理论基础。