PCB118和4--OH--CB107对GT1--7细胞分泌GnRH的影响及机制研究

摘要

多氯联苯118(2，3'，4，4'，5-Pentachlorobiphenyl，PCB118)及其羟基代谢产物4-羟基-多氯联苯107（4-Hydroxy-2，3，3'，4'，5-Pentachlorobiphenyl，4-OH-CB107）均是典型的内分泌干扰物（Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs），对动物及人体具有内分泌干扰效应。针对PCBs（Polychlorinated Biphenyls，PCBs）和羟基多氯联苯(Hydroxylated Polychlorinated Biphenyls，OH-PCBs)内分泌干扰效应的研究主要集中于对动物和人体的甲状腺素和雌激素干扰效应，对神经内分泌干扰效应及相关机制研究相对较少。本研究以小鼠下丘脑永生促性腺激素释放激素（Gonadotropin-Releasing Hormone，GnRH）神经元离体细胞系GT1-7细胞为模型，研究PCB118和4-OH-CB107对GT1-7细胞分泌GnRH的影响及相关机制。 不同浓度PCB118(0～50000nM)和4-OH-CB107(0～500nM)分别处理GT1-7细胞6h、12h、24h和48h，采用CCK-8法检测细胞存活率、AnnexinⅤ-FITC/PI双染法定量检测细胞凋亡和乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)释放试验检测LDH活性，初步探究PCB118和4-OH-CB107分别对GT1-7细胞的毒性作用。选取不同浓度PCB118(0、0.05、5、500、50000nM)和4-OH-CB107(0、0.05、5、500nM)分别处理GT1-7细胞6h和24h，应用ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中GnRH浓度，进而利用蛋白印迹和实时荧光定量PCR技术分别检测Kisspeptin/GPR54信号通路中相关蛋白及其mRNA的表达情况。结果发现，PCB118(0.05～50000nM)处理GT1-7细胞6h、12h、24h和48h后，细胞存活率呈剂量和时间依赖性显著降低，仅高浓度PCB118(50000nM)显著促进LDH的释放和细胞的早期凋亡;PCB118处理GT1-7细胞6h，5、500和50000nM组中GnRH分泌量显著降低，Kisspeptin/GPR54信号通路上GnRH、GPR54、PLC和PKC等蛋白的表达水平显著下降，然而，5nM和500nM PCB118显著下调PLC和PKC基因mRNA的表达水平，对GnRH和GPR54基因mRNA的表达为显著影响;处理24h，500和50000nM PCB118显著抑制GT1-7细胞分泌GnRH，GnRH、GPR54、PLC和PKC等蛋白和基因mRNA的表达水平显著下降。4-OH-CB107(0.05～500nM)处理GT1-7细胞48h显著降低GT1-7细胞存活率;0.05nM4-OH-CB107处理GT1-7细胞6h显著促进GnRH分泌，GnRH、GPR54、PLC和PKC等蛋白和基因mRNA表达水平显著增加;500nM4-OH-CB107处理GT1-7细胞24h显著促进GnRH分泌，GnRH、GPR54、PLC和PKC等蛋白和基因mRNA的表达水平显著增加;虽然5nM4-OH-CB107处理24h未显著影响GnRH分泌量，但能促进GnRH、GPR54、PLC和PKC等蛋白及其基因mRNA的表达。 综上所述，PCB118(0.05～50000nM)和羟基多氯联苯4-OH-CB107(0.05～500nM)均具有抑制GT1-7细胞增殖的毒性作用，具有时间和剂量效应。PCB118仅在50000nM时促进LDH释放和细胞早期凋亡，具有显著细胞毒性;PCB118可通过显著下调Kisspeptin/GPR54信号通路GPR54、PLC和PKC基因mRNA及蛋白表达水平抑制GnRH合成与分泌，其羟基代谢产物4-OH-CB107可通过上调Kisspeptin/GPR54信号通路GPR54、PLC和PKC基因mRNA及蛋白表达水平促进GnRH合成与分泌，但Kisspeptin/GPR54信号通路仅部分介导PCB118和4-OH-CB107干扰GT1-7细胞分泌GnRH。