动物布鲁氏菌感染重组酶聚合酶扩增检测方法的建立

摘要

布鲁氏菌病是一个世界性分布的人畜共患病，能够引起多种动物流产和胎儿死亡，对畜牧业造成很大的经济损失。但目前尚缺少一种快速、灵敏的检测方法用于布鲁氏菌病诊断。本试验以布鲁氏菌的bp26基因为靶基因，建立了实时重组酶聚合酶扩增(RPA)方法，并检测了不同家畜样品中的布鲁氏菌。本试验建立的RPA方法在40℃条件下反应20min，可检测到4个拷贝的含有目的片段的重组质粒。该RPA检测方法的灵敏性为94.9％，特异性为97.0％，分别略低于荧光定量PCR的91.5％和98.5％，但高于普通PCR的93.2％和97.0％。将临床样品分别用虎红平板凝胶试验与RPA方法检测，阳性检出率分别为55.6％和62.2％。该RPA方法与流产衣原体、刚地弓形虫和鼠伤寒沙门氏菌无交叉反应，说明特异性良好。本试验建立的RPA检测方法为下一步研制动物布鲁氏菌的临床检测试剂盒奠定基础。 进一步，本试验将快速侧流式试纸与SYBR greenⅠ重组酶聚合酶扩增技术相结合，建立了检测布鲁氏菌的方法。针对布鲁氏菌bp26基因上的IS711区域设计引物和探针，优化反应条件。RPA在30-35℃的温度下反应10-30min即可产生结果，其灵敏度可检测带有细菌的质粒的6个菌落形成单位和6个质粒拷贝。该方法与流产衣原体、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和弓形虫无交叉反应，特异性较好。应用RPA、PCR和qPCR方法检测田间样品，结果显示，不同方法检测的结果无显著性差异，阳性检出率分别为84.4％、86.6％和84.4％。表明将侧流式试纸与SYBR greenⅠRPA技术结合可以作为诊断布鲁氏菌的方法，用于临床和实验室检测。 本试验研究了特异性检测马耳他型布鲁氏菌(B.melitensis)和流产布鲁氏菌(B.abortus)的双重重组酶聚合酶扩增方法。通过比对B.melitensis和B.abortus基因组中的特异性片段，以B.melitensis假设蛋白和B.abortus膜转运蛋白为目的基因设计引物。反应条件经优化后确定为38℃反应20min。利用双重RPA方法检测B.melitensis的灵敏度为9×102质粒拷贝，检测B.abortus的灵敏度为9×101质粒拷贝。该双重RPA方法与检测B.melitensis bv.3，B.melitensis M5，B.abortus S19和B.suis S2等菌株以及流产衣原体、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和弓形虫其它种病原无交叉反应，说明特异性较好。将青海、内蒙古和新疆收集的62份田间样本，分别利用双重RPA和多重AMOS PCR进行检测。结果显示，双重RPA检测绵羊和牦牛中的B.melitensis的阳性率为77.4％，而流产布鲁氏菌的阳性率为4.8％;多重AMOS PCR结果显示，B.melitensis的阳性率为19.3％，流产布鲁氏菌的阳性率为4.8％。表明本试验建立的双重RPA方法可用于动物布鲁氏菌的流行病学监测。