流感病毒NS1蛋白与宿主DOK6蛋白相互作用研究

摘要

A型流感病毒(IAV)是重要的人兽共患病病原，其基因组由八条单股负链RNA片段组成，极易发生基因突变和重配而导致新病毒产生，给防控带来巨大的挑战。流感病毒复制需要借助宿主生物合成系统、运输系统和能量系统，需要大量宿主因子参与。宿主自身免疫系统通过识别入侵的流感病毒，启动抗病毒信号通路限制病毒复制。同时，流感病毒通过自身蛋白与某些宿主蛋白相互作用，抑制宿主抗病毒信号通路激活。因此，深入研究流感病毒蛋白与宿主蛋白复杂的相互作用网络及过程，有助于抗流感药物的研发。 流感病毒非结构蛋白1(Nonstructural protein1，NS1)是病毒编码的必需蛋白，在病毒复制周期中发挥重要作用。NS1蛋白在病毒入侵宿主后大量表达，抑制宿主干扰素通路的激活，选择性关闭宿主基因的表达且能增强病毒蛋白表达。为深入研究病毒与宿主互作机制，本课题组前期应用免疫沉淀结合质谱分析技术，利用NS1蛋白作为诱饵蛋白，从HEK293T细胞中筛选出与NS1潜在互作的宿主因子停泊蛋白6(Docking Protein6，DOK6)。在本研究中，通过免疫共沉淀实验(Co-IP)，表明DOK6蛋白与NS1蛋白存在相互作用。同时，利用激光共聚焦技术证明两者在细胞质中存在共定位，双分子荧光互补实验(BiFC)证明NS1能够与DOK6蛋白的PTB结构域发生相互作用。蚀斑实验表明过表达DOK6能够抑制流感病毒的复制，而敲除DOK6蛋白则促进病毒复制。双荧光素酶报告基因实验发现DOK6蛋白能提高IFN-β表达，拮抗NS1蛋白对宿主干扰素应答的抑制作用。DOK6蛋白发挥作用的关键结构域是其PH结构域。此外，DOK6蛋白对多个干扰素通路的关键转录因子都有激活作用，且呈剂量依赖性。研究发现DOK6蛋白与宿主TBK1蛋白存在相互作用，并且DOK6蛋白能够通过提高TBK1的磷酸化水平提高TBK1蛋白的活性。DOK6蛋白的PTB结构域与TBK1蛋白发生相互作用，而NS1蛋白能够竞争结合DOK6蛋白的PTB结构域从而抑制DOK6与TBK1的相互作用。 本研究进一步完善了NS1蛋白参与的复杂分子间相互作用网络，为深入理解流感病毒在宿主体内复制的分子调控机制奠定了基础。