大豆FT同源基因GmFT2a和GmFT5a在花期调控中的遗传效应研究

摘要

大豆(Glycine max(L.)Merr.)是典型的短日植物，对光周期反应敏感，在短日照条件(SD)下花期提前，而在长日照条件(LD)下，花期显著延迟。大豆开花期和成熟期因受种植区域生长季节日照长度的影响严重，适宜种植区域普遍比较狭小，光周期反应特性是影响大豆品种区域适应性的重要因素。 在拟南芥中，FLOWER LOCUST(FT)是多条开花通路信号的整合因子。目前，大豆中发现了十个FT的同源基因，其中，GmFT2a和GmFT5a已被证实为主要的开花促进因子。本研究的目的在于剖析GmFT2a和GmFT5a在SD和LD条件下促进开花的遗传效应差异。 大豆GmFT2a和GmFT5a编码区保守，缺少天然的突变体材料。本研究利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术对GmFT2a和GmFT5a进行定点敲除，创制突变体材料。研究结果显示:CRISPR/Cas9在GmFT2a的三个靶点的定点突变效率为36.7％-52.8％，在GmFT5a两个靶点处的突变效率分别为73.7％和70.8％。CRISPR/Cas9在靶点处引入少量碱基的插入和缺失，导致移码突变，产生提前终止密码子，从蛋白水平破坏了基因功能。同时发现，ft2a突变体中的GmFT2a和ft5a突变体中的GmFT5a表达量水平均降低。在T1和T2代中筛选获得了发生定点突变而不携带转基因元件的突变体，并将纯合的fi2a和ft5a突变体杂交，创制了ft2aft5a双基因突变体。 通过串联两个sgRNA表达盒于一个载体上同时靶向两个位点的策略，在GmFT2a中实现了599-1618bp和超过4.5kb的长片段删除，效率分别为15.6％和12.1％;在GmFT5a中实现了1069-1161bp的长片段删除，效率为15.8％。T2代不携带转基因元件的GmFT2a突变体(1618bp长片段删除)在人工控制的LD和SD条件下均显著晚花。 本研究中还创制了GmFT2a和GmFT5a的过表达植株。在LD和SD条件下进行的表型鉴定结果显示:与野生型相比，GmFT2a过表达植株在SD和LD条件下均早花，而GmFT5a过表达植株只在LD条件下早花，在SD条件下没有花期表型差异。在SD条件下，ft2a突变体晚花5.9天;ft5a突变体花期没有显著差异;fi2afi5a双突变体晚花31.3天。在LD条件下，fi2a突变体晚花3.6天;fi5a突变体晚花76.2天;ft2afi5a双突变体超过150天仍未开花。结果表明，GmFT2a和GmFT5a在大豆的花期调控中存在功能互补。虽然都是主要的开花促进基因，但在长、短日照条件下的开花促进效应差异较大:在SD条件下，GmFT2a的开花促进效应比GmFT5a更强，而GmFT5a在LD条件下的开花促进效应更强。 fi2a fi5a双突变体在SD条件下57.4天开花，晚花31.3天;株高较野生型显著提高;野生型节数为10.3个，fi2a fi5a双突变体节数显著增加，为20.0个;野生型的单株荚数和粒数分别为11.9个和27.7个，fi2a ft5a双突变体因在叶腋处产生很多新的分枝，单株荚数和粒数显著增加，分别为54.7个和106.3个。由此可见，fi2a fi5a双突变体能为适应低纬度地区的大豆品种改良研究提供材料。