基于转录组测序挖掘核桃雌雄异熟性相关调控基因

摘要

核桃是雌雄同株异花木本植物。根据雌蕊与雄蕊成熟时期的不同，核桃品种可以分为雌先型(Protogynous)和雄先型(Protandrous)两类。核桃雌雄异熟品种在花期上存在着差异。这种雌雄异熟性直接影响着开花、授粉等有性繁殖过程，影响核桃仁的质量和产量。因此，挖掘核桃雌雄异熟性形成关键基因对提高核仁品质及产量具有极其重要的意义。本研究以核桃雄先型品种‘新早丰’及雌先型品种‘极早丰’为试验材料，研究核桃雌雄异熟品种雌雄花的形态建成，同时对雌雄花芽形态分化的关键时期进行转录组测序，挖掘核桃雌雄异熟性的关键调控基因。本研究的主要内容和结论如下: 1.以‘新早丰’与‘极早丰’整个雌雄花芽发育时期为研究对象，对其雌雄异熟开花进程中雌雄花芽的形态分化特点进行研究。结果表明:河南地区核桃花芽在2月底至3月初进入萌芽期，‘新早丰’与‘极早丰’雌雄花芽的外部形态逐渐开始出现显著性差异(P＜0.05)。该时期可作为‘新早丰’与‘极早丰’雌雄花芽出现显著形态差异的一个关键时期。 2.基于外部形态观测，选择‘新早丰’与‘极早丰’3个时期的雌雄花芽进行石蜡切片观察。结果发现:‘极早丰’雌花芽在3个时期分别处于花被原基分化期、雌蕊原基分化期及雌花成熟期，而‘新早丰’雌花芽分别处于萼片原基分化期、花被原基分化期及雌蕊原基分化期。‘新早丰’雄花芽分别处于雄蕊原基分化期、花药分化期及雄花成熟期，而‘极早丰’雄花芽分别处于苞片原基分化期、雄蕊原基分化期与花药分化期。‘新早丰’与‘极早丰’雌雄花芽的形态分化分别相差一个时期。 3.对‘新早丰’与‘极早丰’3个不同时期的雌雄花芽进行转录组测序，测序获得的clean reads介于43276064到47970628之间，利用从头组装获得的Unigene介于13191到14364之间。根据转录组测序分析结果，共挖掘到11个核桃雌雄异熟机制的相关调控基因:FT-like、FUL-like、SOC1-like、SPL-like、SVP-like、AGL24-like、AP l-like、LEAFY-like、FLC-like、FD-like、DELLA-like。通过qRT-PCR验证了转录组测序的结果。通过结构与功能分析，推测这些基因可能在核桃开花进程中起到关键作用。 4.初步选择了核桃FT-like（WALNUT_00002262）和FUL-like(WALNUT00024135)两个基因作为候选基因，进行同源比较及克隆分析。FT-like的开放阅读框全长525bp，编码174个氨基酸，内含一个PEBP结构域，系统进化分析发现FT-like编码氨基酸序列与拟南芥FT和TSF相似性最高，达到94％;FUL-like的开放阅读框全长747bp，编码248个氨基酸，内含一个MADS-box结构域和一个K-box结构域，系统进化分析发现FUL-like编码氨基酸序列与拟南芥FUL相似性最高，达到72％。因此推测这两个基因是调控核桃开花的关键基因。同时构建了基因过表达载体，为研究这两个基因的功能奠定基础。