利用基因工程途径强化小麦叶酸和花青素含量的研究

摘要

世界上很多人正在遭受营养不良的困扰，而谷类和块茎类作物无法提供所有类型的必需的营养物质。为了解决这一问题，人们尝试了多种方法，比如营养添加剂、食品营养强化和粮食作物生物强化。小麦作为“谷物之王”，是谷物中非常重要的粮食作物，并被认为是全球粮食安全的关键作物。因此，小麦具有很大的生物强化潜力。 叶酸是维持细胞功能的基本要素，包括植物在内的许多生物可以自己合成叶酸。人类与其他脊椎动物一样，靠食物来摄入叶酸，并常因叶酸摄入不足而患上许多疾病。花青素是高等植物合成的次生代谢产物，负责花和果实的着色，也用作常规和分子育种中的可见标记。植物源的花青素也很重要，花青素具有抗炎、抗癌活性，所以摄入花青素可以预防冠心病。MYB和bHLH转录因子参与到花青素生物合成途径中，并与WD40蛋白形成一个三元复合物调控花青素合成通路中的结构基因。在本研究中，评估了中国不同的小麦种质，探索不同小麦种质中叶酸含量的自然变化。此外，通过代谢工程对小麦籽粒进行生物强化以获得高叶酸含量。首先，将参与叶酸前体蝶呤和对氨基苯甲酸合成的大豆基因GmGCHI(GTP cyclohydrolase I)和GmADCS(aminodeoxychorismate synthase)分别在胚乳启动子水稻GluC和玉米Leg1A的控制下在小麦中表达。另外，将大豆密码子优化的GmGCHI和番茄LeADCS基因在小麦胚乳特异性谷蛋白(1Dx5)启动子控制下共转化小麦。同时，在小麦中分别表达和共表达玉米MYB和bHLH，评估这些基因在小麦中的功能。主要研究结果如下: 1.利用HPLC-MS/MS测定了360份小麦样品（包含315个小麦品种）的叶酸含量，发现小麦品种间叶酸含量的差异为10.15±2.86～91.44±5.64μg/100g。河农58-3等52个小麦品种叶酸含量较高，超过50μg/100g，是小麦高叶酸含量育种的理想资源。同时发现，环境因素对小麦中叶酸含量有很大影响，如良星66在石家庄、北京和郑州每100克籽粒中叶酸含量分别为36.9、29.4和57.5μg，石4185在石家庄、北京和郑州每100克籽粒中的叶酸含量分别为20.4、28.3和41.5μg。 2.发现在小麦籽粒中叶酸主要以5-甲酰基四水合物(5-CHO-THF)和5-甲基四氢叶酸(5-CH3-THF)的形式存在，占叶酸总量的50％以上。 3.为了提高小麦植株的叶酸含量，利用农杆菌转化法在小麦中过表达2个与叶酸合成相关的大豆基因GmGCHI和GmADCS，发现转基因小麦籽粒中叶酸含量为65μg/100g，相比受体对照的28μg/100g提高了2.3倍。 4.进一步利用农杆菌转化法将大豆密码子优化的GmGCHI基因和番茄LeADCS基因在小麦中表达，发现转基因小麦籽粒中叶酸含量为127μg/100g，相比受体对照的23μg/100g提高了5.6倍。 5.利用农杆菌转化法将玉米ZmC1(MYB-C1)和ZmR(bHLH R)基因转入小麦，发现ZmC1和ZmR在转基因植株中以组织特异性方式调控花青素的生物合成。 6.过表达ZmC1和ZmR的小麦转基因植株在叶、茎、叶耳、小穗和籽粒等几乎所有组织都显示高色素沉积;过表达ZmC1的小麦转基因植株在胚芽鞘、叶耳和茎中显示色素沉积，表明ZmC1调控营养组织中的色素沉积;表达ZmR基因的小麦转基因植株在籽粒中显示出高色素沉积，表明ZmR调控籽粒中的色素沉积;在表达ZmC1和ZmR的转基因小麦植株中花青素含量达到了6.51mg/kg。 7.利用qRT-PCR技术分析了转基因植株中ZmC1和ZmR、2个小麦同源基因(TaC1和TaR)、6个花青素合成相关基因(TaCHS、Ta CHI、TaF3H、TaF3H、TaDFR和TaANS)的表达水平，发现它们在转基因小麦植株中都显著上调表达。