异种（猪）脱细胞真皮基质激光微孔化并与rADSCs体外预培养促进体内构建真皮-脂肪复合物的实验及机制研究

摘要

目的:皮瓣移植是临床重要的修复重建技术,但是切取自体皮瓣对供瓣区损伤很大,利用组织工程技术构建皮瓣有望解决这一难题。真皮脂肪复合组织是皮瓣的主要组成部分,其构建是皮瓣构建首先要解决的难题。本研究尝试基于异种(猪)脱细胞真皮基质(PADM)在体内构建真皮脂肪复合组织。PADM结构致密,入体后宿主细胞难以进入,血管化缓慢,并会引发一定程度的炎症反应,给带来构建困难。本研究应用两种体外预处理方法共同对其进行优化:第一,激光微孔化(LMT)处理;第二,与自体脂肪间充质干细胞(rADSCs)预培养。本研究旨在探索激光微孔化前后的PADM是否能提供有利于脂肪干细胞发挥其作用的微环境,并验证体外优化处理是否能促进PADM入体后血管化,并降低炎症反应强度,从而构建出具有相当力学强度的真皮脂肪复合组织。方法:首先利用二氧化碳激光打孔机对PADM进行处理,使其产生孔径、孔距皆为1mm的微孔。然后将rADSCs以1×105/孔的密度接种于PADM、激光微孔化PADM(LPADM)以及普通培养皿上,检测不同环境下培养的rADSCs其促血管形成及炎症调节相关基因表达及蛋白产物的差异。将PADM及LPADM分别埋入大鼠背部,4周后取材观察LMT对PADM体内血管化的作用;将2×105数量的rADSCs与PADM在体外共培养一周,并与未处理PADM一同埋入大鼠背部,4周后取材观察rADSCs共培养对PADM体内血管化的作用。最后将未经体外预处理的PADM及经过优化的rADSCs-LPADM分别埋入大鼠背部皮下,2周后植入混合干细胞的自体脂肪。术后4周取材,进行大体观、组织学及生物力学检测。结果:激光微孔化处理及rADSCs体外预培养均能够显著增加PADM入体后的血管新生率,并且与rADSCs共培养的PADM入体后引发的炎症反应显著缓解。激光处理前后的PADM都能为rADSCs提供有益的微环境,提升rADSCs促血管形成基因(VEGF、bFGF、HGF),炎症调节基因(TGF-β、TSG-6、COX-2,iNOS)及干性基因(SOX-2)的表达,其中PADM的效果更好。体内复合组织构建结果显示,经过LMT及rADSCs体外预培养共同处理后的PADM与未经处理的PADM相比,植入物入体后引发的炎症反应明显减弱,局限化,能快速血管化,二期移植的脂肪成活增加,最终形成的真皮-脂肪复合组织生物力学强度更佳。结论:LMT能够有效促进PADM入体后的宿主细胞渗入及血管新生。与rADSCs体外共培养能够促进PADM入体后的血管化并缓解炎症反应。PADM/LPADM都能够提供有利于rADSCs发挥其旁分泌功能的微环境,而rADSCs的旁分泌产物则能够促进血管新生、调节炎症反应,使得材料与种子细胞产生相辅相成的作用。经过体外预处理优化后的rADSCs-LPADM与混合干细胞的自体脂肪分步植入大鼠背部,能够构建出拥有充分力学强度的真皮-脂肪复合组织。本研究为下一步构建具有表皮-真皮-脂肪全层结构的皮瓣组织奠定了基础。

目录

摘要

Abstract

缩略词说明

绪论

第一章 体外异种ADM预处理:激光微孔化及与rADSCs共培养

1 前言

2 主要实验材料

2.1 主要试剂

2.2 主要仪器、耗材

2.3 实验动物

3 实验方法和步骤

3.1 PADM激光微孔化处理

3.2 PADM/LPADM性质检测

3.3 rADSCs的分离培养与鉴定

3.4 细胞与材料相容性检测

3.5 rADSCs旁分泌功能相关基因表达的检测

3.6 旁分泌产物体外功能检测

4 结果

4.1 PADM/LPADM的材料性质

4.2 大鼠脂肪干细胞性质

4.3 PADM及 LPADM的细胞相容性

4.4 不同材料微环境对rADSCs旁分泌功能的影响

5 讨论

6 小结

第二章 基于LPADM-rADSCs体内构建真皮-脂肪复合物

1 前言

2 主要实验材料

2.1 主要试剂

2.2 主要仪器设备

2.3 实验动物

3 实验方法和步骤

3.1 实验分组

3.2 PADM材料准备及体外预处理

3.3 PADM/LPADM体内血管化比较及力学分析

3.4 PADM/rADSCs-PADM体内血管化比较

3.5 真皮-脂肪复合物构建的动物实验过程

3.6 构建皮瓣大体观

3.7 构建的真皮-脂肪复合物组织学染色

3.8 构建的真皮-脂肪复合物免疫组化染色

3.9 真皮-脂肪复合物翻转修复邻近创面的动物实验过程

4 结果

4.1 PADM及 LPADM体内血管化差异

4.2 PADM及 rADSCs-PADM体内血管化及炎症反应差异

4.3 PADM及 LPADM体内外力学强度比较

4.4 体外预处理对PADM体内构建真皮-脂肪复合组织的影响

5 讨论

6 小结

全文总结

References

致谢

攻读硕士学位期间发表论文及成果