拟南芥中两种动蛋白异型体KatB/KatC生化性质及组织分布研究

摘要

动蛋白是一类依赖于微管的马达蛋白，它能利用ATP水解产生的能量沿微管运动。动蛋白具有依赖于核苷酸的微管结合特性和被微管激活的ATPase特性，这两个特性由动蛋白的头部马达区负责。动蛋白组成一个庞大的动蛋白超家族，广泛存在真核细胞，参与了众多的生物学过程，如细胞器运输、有丝分裂和减数分裂、微管的动态调节以及信号转导等。拟南芥中存在着61个动蛋白异型体。KatB和KatC是于1993年从拟南芥中最早克隆出的五个动蛋白基因中的两个，属于C端马达蛋白，它们所编码蛋白质的氨基酸同源性高达84％。虽然其基因很早就被克隆，但有关二者的生物化学特性和功能报道很少。深入研究KatB和KatC的体外生物化学特性和体内组织分布规律，对揭示植物动蛋白异型体的功能作用具有重要的理论意义。 本研究利用KatC的N-端尾部区域(128aa)的cDNA序列构建了原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达、纯化。与微管的共沉淀实验表明，KatCN-端尾部区域能与微管结合，而且这种结合不依赖于ATP。冷CCD荧光显微观察结果表明，KatCN-端尾部区域不能引起微管的成束。为了确定负责与微管结合的最小区域，构建了6段不同长度的原核表达载体，并进行了表达、纯化；纯化的各删除片段用来与微管进行共沉淀分析。结果表明，KatCN端尾部区域的第74-86aa肽段是负责与微管结合的区域，而且包含此区域的不同删除片段与微管的结合比不同，说明这一微管结合位点可能是构象依赖型的。点突变实验结果进一步表明，Arg77和Arg79在KatC的N-端尾部区域与微管结合的过程中起着关键性的作用。同时构建、表达、纯化了KatB的除去马达区的385个氨基酸的片段，其与微管的共沉淀实验表明，KatB在尾部区域同样也存在着第二个微管结合位点。 将含有KatB、KatC杆区的KatB和KatC区段分别融合His、GST，各产生了两种带不同标签的融合蛋白，通过Pulldown实验研究KatB、KatC各自及二者的相互作用。实验结果表明，KatB、KatC不但各自可以自己相互作用，形成同源二聚体，二者也可以相互作用形成异源二聚体。 用gus作为报告基因，对KatB和KatC启动子驱动的gus活性进行比较。结果表明：(1)KatB和KatC启动子在根部都有活性，但具体部位不同。KatC启动子的活性主要集中在根尖分生区及幼嫩的根毛中。而KatB启动子除了在分生区有活性外，在中柱内及不同发育时期的侧根内都有较强的活性。(2)KatB启动子驱动的gus在叶原基、叶脉、叶毛、花药、果荚中都有活性，但KatC启动子驱动的gus却只在果荚中有活性。 为了进—步了解KatB、KatC在植物体内的分布，分别选用KatB特异肽段及KatC的特异肽段为抗原，制备抗血清。经亲和纯化的抗体能够特异地识别KatB、KatC而无免疫交叉反应。用免疫印迹对KatB、KatC在拟南芥中的组织分布进行了研究，结果表明：KatB在拟南芥中，除了果荚外，在幼苗、根、茎、叶和花中都有表达，但KatC在叶和花中表达很弱，却在果英里表达较强。 为了了解KatB、KatC在植物体内的功能，分别鉴定、筛选出拟南芥KatB、KatCT-DNA单插入突变体。通过对KatB和KatC单突变体杂交，获得了双突变纯合体。初步表型观察表明，KatB、KatC单基因突变及双基因突变都不影响植株的正常生长、发育，这说明KatB、KatC基因的功能也可被其它基因所替代。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

独创性声明及关于论文使用授权的说明

1文献综述—动蛋白研究进展

1.1动蛋白的生化性质

1.2动蛋白的结构

1.3动蛋白超家族的分类、命名与系统进化树

1.4动蛋白的功能

1.5高等植物中的动蛋白

1.6拟南芥中的动蛋白研究

1.7本研究的目的和意义

2 KatB/KatC的体外生化性质的研究

2.1引言

2.2实验材料

2.3实验方法

2.4结果与分析

2.5讨论

3 KatB和KatC的体内组织分布

3.1引言

3.2实验材料

2.3实验方法

2.4结果与分析

2.5讨论

4 KatB/KatCT-DNA单插入突变体及双突变体的获得及表型的初步观察

4.1引言

4.2实验材料

4.3实验方法

4.4实验结果与分析

4.5讨论

第五章 结论

参考文献

致 谢