奶牛瘤胃微生物元基因组文库中脲酶和脂肪酶克隆的筛选与分析

摘要

本研究从奶牛瘤胃微生物中筛选得到了脲酶和脂肪酶阳性克隆，对其酶学性质进行分析，并勾画了尿素分解菌多样性，共包括三个部分： 第一部分：利用脲酶选择性培养基，从奶牛瘤胃微生物BAC文库的15360个克隆中筛选得到了16个脲酶克隆。利用酚-次氯酸法对脲酶克隆的酶活性分析，表明均具有不同的尿素分解能力，酶的活力范围是30～2466 U/mg。脲酶阳性克隆插入片段大约是60 kb，限制性内切酶HindⅢ酶切图谱表明，各个克隆具有不同DNA片段，其中脲酶U1、U3、U4和U9的最适pH为8．0，最适温度为60℃。 第二部分：提取16个脲酶克隆的质粒，利用脲酶保守序列ureC引物和细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化E．coli JM109，挑取阳性克隆测序。利用Blast程序将序列与GenBank和RDP数据库进行比对，并使用Mega4．0软件构建系统发育树。4个脲酶克隆含有脲酶保守序列ureC，系统发育树分析表明，U1、U5、U13和U15分别属于Firmicutes，ε-Proteobacteria，β-Proteobacteria和Actinobacteria；7个脲酶克隆含有16S rDNA，经过系统发育分析，U1、U3、U7、U10、U11、U12和U14分别属于Staphylococcus，Shigella，Bacillus，Acinetobacter，Achromobacter，未培养微生物和Bacillus。本研究表明奶牛瘤胃微生物脲酶基因和尿素分解菌具有多样性的特点。 第三部分：利用含有三油酸甘油酯的脂肪酶选择性筛选培养基，从奶牛瘤胃微生物元基因组文库15360个克隆中，筛选得到了18个脂肪酶阳性克隆，其插入片段大约为60 kb，并且各个克隆的插入片段各不一样。利用p-NPP法对脂肪酶克隆的脂肪酶活性分析，表明均具有大小不等的脂肪酶活性。底物特异性分析表明Lipase6、Lipase7和Lipase8分别对C16底物（对硝基苯棕榈酸酯）、C12底物（对硝基苯月桂酸酯）和C16底物（对硝基苯棕榈酸酯）水解能力最强。Lipase6，Lipase7，Lipase8的脂肪酶最适pH为7．5；Lipase8的脂肪酶活性半衰期随反应温度的升高而缩短，70℃时能达到30 min。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录

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第一章 绪论

1脲酶

1.1细菌脲酶的生化性质

1.2细菌脲酶基因簇

1.3细菌脲酶是镍金属蛋白酶

1.4细菌脲酶的表达调控方式

2脂肪酶

2.1脂肪酶来源

2.2 pH和温度动力学

2.3在有机溶剂里的稳定性

2.4金属离子的影响

2.5脂肪酶的抑制剂

2.6底物特异性

附表

3元基因组学

3.1元基因组学研究方法

3.2胃肠道微生物元基因组学

3.3瘤胃微生物元基因组学

4研究目的和意义

5研究内容

第二章 奶牛瘤胃微生物BAC文库中脲酶克隆的筛选与分析

1材料与方法

1.1菌株来源

1.2奶牛瘤胃微生物BAC文库

1.3脲酶阳性克隆的筛选

1.4脲酶活性测定

1.5脲酶的最适pH调整

1.6脲酶的最适温度

2结果

2.1筛选脲酶阳性克隆

2.2脲酶阳性克隆酶活力测定

2.3脲酶的最适pH

2.4脲酶的最适温度

3讨论

3.1奶牛瘤胃微生物BAC文库中筛选脲酶克隆

3.2脲酶克隆酶活力的差异

3.3脲酶的最适pH和温度

4结论

第三章 元基因组学方法分析奶牛瘤胃尿素分解菌的多样性

1材料与方法

1.1材料

1.2质粒的提取和纯化

1.3脲酶基因克隆文库的建立

1.4 16S rDNA文库建立

1.5基因测序和系统发育分析

2结果与分析

2.1 ureC和16S rDNA克隆文库

2.2 ureC系统发育分析

2.3 16S rDNA系统发育分析

2.4 核酸序列登录号

附图

3讨论

4结论

第四章 奶牛瘤胃微生物元基因组文库中脂肪酶克隆的筛选与酶学性质

1材料与方法

1.1材料

1.2脂肪酶阳性克隆筛选

1.3脂肪酶活性测定

1.4脂肪酶的底物特异性

1.5脂肪酶的最适pH

1.6脂肪酶的热稳定性

2结果与分析

2.1脂肪酶阳性克隆的筛选

2.2脂肪酶酶活性

2.3脂肪酶的底物特异性

2.4脂肪酶的最适pH

2.5脂肪酶热稳定性

3讨论

4结论

总体结论和展望

参考文献

附 录

致 谢

个人简历

导师简历