SUMO化信号通路相关基因在拟穴青蟹性腺发育过程中的作用研究

摘要

SUMO化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，它参与转录因子的活性、核质运输、信号转导、细胞周期、线粒体分裂、DNA损伤修复及基因组稳定等多种分子调节过程，目前SUMO化信号通路参与生殖调控的研究已越来越受到重视。本研究在本实验室已构建的青蟹EST数据库的基础上，通过生物信息学分析筛选出SUMO化信号通路相关基因片段，克隆这些基因的全长cDNA序列，利用实时荧光定量PCR技术研究了这些基因在拟穴青蟹不同组织及性腺不同发育阶段的表达模式，并进一步采用原位杂交及免疫组化的技术研究了部分基因在拟穴青蟹配子发生过程中的定位，获得结果如下: 1)本研究克隆获得了SUMO化信号通路上的四个基因SpSUMO-1、Sp-Uba2、 Sp-NSE2及Sp-SENP1的全长cDNA序列:SpSUMO-1的全长cDNA为732bp，其中开放阅读框282bp，编码93个氨基酸;Sp-Uba2 cDNA全长为2519bp，其中开放阅读框1944bp，编码647个氨基酸;Sp-NSE2 cDNA全长为1144bp，其中开放阅读框633bp，编码210个氨基酸;Sp-SENP1 cDNA全长为2077bp，其中开放阅读框1455bp，编码484个氨基酸。 2)实时荧光定量PCR结果显示SpSUMO-1、Sp-Uba2、 Sp-NSE2及Sp-SENP1基因在卵巢中的表达均显著高于其它各组织;而在性腺发育过程中，这四个基因的表达水平随着卵巢发育的成熟而呈下降趋势，在增殖期它们的表达水平均最高且显著高于其它各期的表达水平(P＜0.05)。在精巢的不同发育阶段，这四个基因的表达水平相对恒定且各时期之间的表达水平无显著差异。而且在卵巢发育早期（第Ⅰ-Ⅲ期）这四个基因的表达水平显著高于其在精巢各发育阶段的表达水平(P＜0.05)。 3)原位杂交结果显示SpSUMO-1、Sp-Uba2、 Sp-NSE2及Sp-SENP1基因在卵子发生过程的表达模式类似，在增殖期至卵黄发生早期，这四个基因均泛表达于卵原细胞和卵母细胞的细胞质和细胞核中，在卵黄发生中期及晚期，这四个基因主要集中在细胞核中表达。在精子发生过程中，SpSUMO-1在整个精子发生过程中都有表达，在初级精母细胞、精细胞及精子细胞的细胞核的阳性信号较强。同时，在精子细胞的顶体管也能检测到阳性信号。 4)免疫组化结果显示，在整个卵子发生过程中，SpSUMO-1主要定位于所有卵原细胞及卵母细胞的细胞质中;在精子发生过程中，SpSUMO-1在精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞及精细胞中均能检测到阳性信号，但是在精子细胞中，其阳性信号只在细胞核中检测到。

目录

声明

摘要

主要符号表

第1章 引言

1．1 拟穴青蟹的生物学特性

1．2 虾蟹性腺发育的研究进展

1．3 SUMO分子及SUMO化修饰途径

1．3．1 SUMO家族

1．3．2 SUMO化信号通路的分子机制

1．4 SUMO化信号通路参与生殖过程的研究

1．5 SUMO化信号通路在甲壳动物中的研究进展

1．6 本研究的目的意义

1．7 本研究的技术路线

第2章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 拟穴青蟹

2．1．2 主要试剂盒

2．1．3 引物

2．2 方法

2．2．1 总RNA的提取

2．2．2 EST序列分析获取目的基因片段

2．2．3 SMART-RACE方法克隆目的基因全长

2．2．4 割胶纯化目的基因片段

2．2．5 与载体连接

2．2．6 转化与筛选

2．2．7 单克隆检测

2．2．8 目的基因的生物信息学分析与功能预测

2．2．9 SUMO化信号通路上若干相关基因在不同组织及性腺各个不同时相的表达模式

2．2．10 石蜡切片

2．2．11 原位杂交技术检测SUMO化信号通路若干相关基因在生殖细胞中的表达与定位

2．2．12 免疫组织化学技术检测SpSUMO-1蛋白生殖细胞中的表达与定位

第3章 SUMO化通路相关基因的克隆与序列分析

3．1 SpSUMO-1基因序列分析

3．1．1 拟穴青蟹SUMO-1(SpSUMO-1)全长cDNA序列分析

3．1．2 SpSUMO-1二级结构和空间模拟结构预测

3．1．3 SpSUMO-1与其他物种的SUMO-1同源性分析

3．2 Sp-Uba2基因序列分析

3．2．1 拟穴青蟹Uba2(Sp-Uba2)全长cDNA序列分析

3．2．2 Sp-Uba2二级结构和空间模拟结构预测

3．2．3 Sp-Uba2与其他物种的Uba2同源性分析

3．3 Sp-NSE2基因序列分析

3．3．1 拟穴青蟹NSE2(Sp-NSE2)全长cDNA序列分析

3．3．2 Sp-NSE2二级结构和空间模拟结构预测

3．3．3 Sp-NSE2与其他物种的NSE2同源性分析

3．4 Sp-SENP1基因序列分析

3．4．1 拟穴青蟹SENP1(Sp-SENP1)全长cDNA序列分析

3．4．2 Sp-SENP1二级结构和空间模拟结构预测

3．4．3 Sp-SENP1与其他物种的SENP1同源性分析

第4章 SUMO化通路相关基因的表达特征

4．1 各基因在拟穴青蟹雌蟹个体各组织中的表达特征

4．1．1 SpSUMO-1基因在雌蟹个体各组织中的表达水平

4．1．2 Sp-Uba2基因在雌蟹个体各组织中的表达水平

4．1．3 Sp-NSE2基因在雌蟹个体各组织中的表达水平

4．1．4 Sp-SENP1基因在雌蟹个体各组织中的表达水平

4．2 各基因在拟穴青蟹性腺发育不同阶段的表达特征

4．2．1 SpSUMO-1基因在性腺发育不同阶段的表达

4．2．2 Sp-Uba2基因在性腺发育不同阶段的表达

4．2．3 Sp-NSE2基因在性腺发育不同阶段的表达

4．2．4 Sp-SENP1基因在性腺发育不同阶段的表达

4．3 各基因在拟穴青蟹卵子发生及精子发生过程中的定位表达

4．3．1 各基因在拟穴青蟹在卵子发生中的定位表达

4．3．2 SpSUMO-1在拟穴青蟹在精子发生中的定位表达

4．4 SpSUMO-1蛋白在拟穴青蟹卵子发生及精子发生过程中的定位表达

4．4．1 SpSUMO-1蛋白在拟穴青蟹卵子发生过程中的定位表达

4．4．2 SpSUMO-1蛋白在拟穴青蟹精子发生过程中的定位表达

第5章 讨论

5．1 SUMO化信号通路上若干相关基因的结构

5．2 SUMO化信号通路上若干相关基因的表达

第6章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

致谢

参考文献

在学期间发表的学术论文和研究成果