新疆草花提取物(GHE)对Aβ致痴呆大鼠模型的保护作用及其炎症机制探讨

摘要

目前，对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的治疗尚缺乏有效手段，而越来越多的研究将重点转移到中草药，原因是中草药是天然来源，比合成药物更安全。中草药的成分复杂，对于病理机制复杂的疾病，可能具有更好的疗效。此外，中草药的代谢谱对于药物活性成分筛选具有重要价值，为药物的研发及作用机制阐述提供了线索。新疆草花(GossypiumherbaceamL．，GH)是新近开发的一种产于新疆、用于治疗记忆力减退的民间药物。该药物的治疗作用仅限于民间经验，对其改善学习记忆损伤的药效及确切机制尚无报道。在本研究中，将新疆草花提取物(Gossypium herbaceamL．extracts，GHE)用于治疗Aβ25—35诱导的急性学习记忆损伤大鼠，同时使用多奈哌齐(donepezil)作为阳性对照药，观察GHE能否对抗Aβ诱导的损伤作用。在整体水平评价GHE的神经保护作用及抑制细胞凋亡效果，并对其抗Aβ诱导神经炎症的机制进行阐述，为开发安全有效的神经保护新药提供依据。 随着对AD病理机制研究的深入，炎症反应已经受到越来越多的关注。大量研究证明，AD的发病及进展过程中都伴随着炎症反应的发生。其中，胶质细胞(小胶质细胞和星形胶质细胞)在AD的神经炎症机制中发挥了重要作用。Aβ的病理性聚积会激活胶质细胞(尤其是小胶质细胞)，诱导炎症介质释放增加，继而将诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)激活，产生一氧化氮(nitric oxide，NO)及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，后者又可以与活性氮簇(reactive nitrogen species，RNS)作用，生成过氧化亚硝酸盐。这种过氧化物能对细胞产生很强的毒性，从而引发细胞凋亡。此外，小胶质细胞和星形胶质细胞的相互作用还会进一步增加炎症因子前体、补体以及氧化物的产生。这些炎症介质和氧化物的产生会导致Aβ的进一步聚积，从而将细胞内炎症因子介导的级联反应进一步扩大，使之进入恶性循环。另一方面，胶质细胞，尤其是星形胶质细胞，在神经退行性病变过程中还发挥了神经保护的作用。有研究证明，两种胶质细胞被激活后还可以通过释放神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)及抗炎细胞因子(如IL—4，IL-10等)对抗炎症反应，起到细胞保护的作用。这就是胶质细胞的“双刃剑”效应。基于上述理论，本文采用目前国际上公认的更接近于AD病理机制的长期侧脑室注射Aβ25—35诱导的慢性学习记忆损伤模型，观察并比较在AD病理进程中胶质细胞发挥的炎症损伤和神经保护两方面的作用，阐述Aβ激活胶质细胞致学习记忆损伤的神经通路，为今后的药物靶点筛选及新药研发奠定了基础。 第一部分新疆草花提取物(GHE)对Aβ致痴呆大鼠模型的保护作用。 1.GHE由很多成分组成，指纹图谱显示主要成分的保留时间分别为18.36，18.46，18.56，19.51，20.46，20.79，21.99，22.26及23.37。 2.成年雄性SD大鼠随机分为6组：假手术对照组(Control)，侧脑室单次注射生理盐水加灌胃给予蒸馏水14天；模型组(Model)，侧脑室单次注射Aβ25—35加灌胃给予蒸馏水14天；阳性药多奈哌齐组(Donepezil)，侧脑室单次注射Aβ25—35加灌胃给予多奈哌齐0.6mg/kg14天；GHE低剂量组(GHE—L)，侧脑室单次注射Aβ25—35加灌胃给予GHE35mg/kg14天；GHE中剂量组(GHE—M)，侧脑室单次注射Aβ25—35加灌胃给予GHE70mg/kg14天；GHE高剂量组(GHE—H)，侧脑室单次注射Aβ24—35加灌胃给予GHE140mg/kg14天。 3.水迷宫测试结果证明，与假手术对照组相比，模型组大鼠寻台潜伏期明显延长(P<0.01)，而给药多奈哌齐(P<0.01)及GHE 35 mg/kg和GHE 70 mg/kg(P<0.05)后大鼠寻台潜伏期明显缩短，但结果不具有剂量依赖关系。 4.避暗测试结果显示，多奈哌齐和GHE(70 mg/kg)给药能够显著改善Aβ诱导的恐惧记忆损伤，降低大鼠避暗实验的错误次数。此外，GHE给药在一定程度上延长了避暗实验的潜伏期，但是差异没有达到统计学意义。 5.Nissl染色结果证明，与假手术对照组相比，Aβ25—35侧脑室注射显著下调大鼠海马CA1区健康神经元密度，神经元活力明显降低(P<0.05)，而GHE 70 mg/kg连续给药14天能够逆转Aβ诱导的损伤，且结果具有统计学意义(P<0.05)。 6.TUNEL结果证实，模型组大鼠海马齿状回区出现较多的可以检测到的凋亡细胞，而给药各组大鼠海马齿状回区仅偶尔可见凋亡神经元。 7.生化检测结果表明，与假手术对照组相比，模型组大鼠海马区GSH-Px和CAT的酶活力显著降低，给药GHE 35 mg/kg和GHE 70 mg/kg后，GSH-Px和CAT的酶活性显著增加。但GHE对SOD的活性和MDA的含量没有影响。 8.ELISA和western blotting检测结果显示，侧脑室注射Aβ25—35显著诱导大鼠海马区IL-1β含量升高(P<0.01)，而IL-1RA的表达也有一定程度的升高，但IL-1RA/IL-1β的比率显著降低(P<0.01)，说明IL-1炎症系统激活。而给药GHE70mg/kg和140mg/kg后，IL-1β含量显著降低，同时IL-1RA/IL-1β的比率显著升高，说明GHE能够有效对抗Aβ诱导的IL-1系统的炎症反应。 9.本文分别采用western blotting和EMSA方法对炎症因子NF—κB的核转位及活性进行了检测。结果证明，GHE能够有效抑制Aβ25—35诱导的NF—κB核转位及激活。机制是给药GHE 70和140 mg/kg后能够显著抑制Aβ25—35诱导的IκB-α的降解(P<0.05)。免疫组化染色结果进一步证明，Aβ25—35能够显著上调大鼠海马CA1和CA3区细胞核内NF—κB的表达(P<0.01)。GHE和多奈哌齐阳性药能够不同程度地抑制胞核内NF—κB的表达。 第二部分长期侧脑室注射Aβ致痴呆模型的炎症机制探讨。 1.成年雄性Long Evans大鼠随机分为2组：假手术对照组(NS)，侧脑室注射生理盐水，每天5μl，连续14天；Aβ模型组(Aβ)，侧脑室注射Aβ25—35，每天300 pmol(5μ)，连续14天。 2.水迷宫测试结果显示，与假手术对照组组相比，长期侧脑室注射Aβ25—35可导致大鼠的寻台潜伏期明显延长(P<0.01)。 3.免疫组织化学结果证明，与假手术对照组相比，Aβ模型组大鼠海马CA1、CA3和DG区的GFAP染色较深且阳性细胞显著增多，说明GFAP的表达增加，星形胶质细胞大量激活，统计结果表明此差异具有统计学意义(P<0.01)；而小胶质细胞标志物Ibal染色阳性细胞在海马CA1区显著增多(P<0.05)，说明长期侧脑室注射Aβ25—35也诱导海马区小胶质细胞激活。此外，real-Time PCR结果进一步证实，星形胶质细胞(P<0.01)和小胶质细胞标记物(P<0.05)的基因转录水平在Aβ模型组大鼠海马区均呈现出显著增加的趋势。 4.通过细胞因子检测技术Bio-Plex对接受Aβ25—35长期侧脑室注射的大鼠脑海马区9种细胞因子进行了检测，结果表明，IL-1α(P<0.01)，IL-1β(P<0.01)和TNF-α(P<0.05)三种细胞因子受Aβ25—35的诱导出现显著上调；抗炎因子IL—4出现明显下调，但由于其标准差较大，此差异没有达到统计学意义。 5.采用western blotting和ELISA检测方法对大鼠海马区NTFs及其受体的表达进行检测，结果发现，长期侧脑室注射Aβ25—35能够显著上调BDNF(P<0.01)和GDNF(P<0.05)的蛋白表达水平；同时，显著下调NGF(P<0.01)和p75NTR(P<0.05)的蛋白表达。Real-TimePCR结果证明，受Aβ25—35的诱导，NTFs及其受体的基因转录水平呈下降的趋势，其中BDNF(P<0.05)和TrkB(P<0.05)的下调具有统计学意义。 6.对大鼠血清中皮质酮水平的检测结果表明，长期侧脑室注射Aβ诱导血清中皮质酮浓度显著升高(P<0.05)。 7.Western blotting和real-Time PCR结果均显示，Aβ能够诱导大鼠海马区APP蛋白表达水平和基因转录水平出现一定程度的变化，但此差异没有统计学意义。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第一部分新疆草花提取物(GHE)对Aβ致痴呆大鼠模型的保护作用

前 言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

结 果

图 表

讨 论

结 论

第二部分长期侧脑室注射Aβ致痴呆模型的炎症机制探讨

前 言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

结 果

图 表

讨 论

结 论

参考文献

综述一 胶质细胞在阿尔茨海默病中的作用

综述二 阿尔兹海默病的神经生长因子基因治疗

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致 谢