CD106是具有强免疫调节功能的胎盘绒毛膜间充质干细胞的标志

摘要

背景:间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)可以从多个组织中获得。由于它具有免疫调节功能，可以调节T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等的免疫学活性，因此被认为在治疗多种免疫相关的难治性疾病上有良好的潜能。目前分离MSC的方法主要是用贴壁法分离MSC，但这样分离的MSC是一个混杂的群体，其中的细胞可能具有不同增殖、分化和造血支持方面的能力。使用特定的表面或者细胞内标记，可以鉴别不同的MSC亚群。但是，目前的MSC亚群分类的研究主要集中于BM-MSC，并且主要是针对其增殖和分化能力方面，而很少有在免疫调节能力方面的亚群分类。
　　 目的:从胎盘绒毛膜(chorionic villi，CV)间充质干细胞中分离CD106+和CD106-的细胞，比较CD106+和CD106-CV-MSC在形态，克隆形成，分化，免疫调节能力的差异。
　　 方法:(1)使用流式细胞术分析比较骨髓，脂肪，脐带和胎盘绒毛膜来源的MSC之间表型的差异。将PHA刺激的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcells，PBMC)与各种MSC共培养，ELISA检测上清中IFN-γ(interfern-γ)的分泌。用实时定量PCR检测这四种MSC在免疫相关基因表达上的一些差异。ELISA检测四种MSC分泌PGE2(prostaglandin E2)能力的差异。(2)从CV-MSC分离得到CD106+和CD106-的CV-MSC;倒置显微镜观察两者的细胞形态。体外定向诱导CD106+和CD106-的CV-MSC向脂肪细胞和骨细胞分化，用油红O，茜素红S染色分别比较两种MSC的分化能力。将CD106+和CD106-的CV-MSC以较低浓度种入T75培养瓶中培养，14天后，用结晶紫染色，比较其集落形成单位数。(3)将PHA刺激的人外周血单个核与CD106+和CD106-CV-MSC分别共培养，ELISA检测培养上清中的IFN-γ和TNF-α(tumor necrosis factor-α)的分泌。用免疫磁珠法从脐血单个核中分选得到脐血CD4+T细胞，用PHA和IL-2刺激，与CD106+和CD106-CV-MSC共培养，ELISA检测IFN-γ和TNF-α的分泌;使用transwell阻止CD4+T细胞和MSC的直接接触后检测IFN-γ的分泌变化;用实时定量PCR检测共培养后CD4+T细胞内IFN-γ，TNF-α和T-bet的mRNA的变化。使用IL-2刺激CD4+T细胞，将CD4+T细胞与CD106+和CD106-CV-MSC共培养，流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+细胞的比例。(4)磁珠分选脐血CD34+细胞，用不含生长因子的甲基纤维素的培养基与CD34+细胞混合后加入CD106+和CD106-CV-MSC的条件培养基。刺激2周和3周后，显微镜下计数集落形成单位，观察集落大小。刺激3周后收集细胞，计数，并进行流式检测。(5)采用Affymetrix基因表达谱检测方法比较分析CD106+和CD106-的CV-MSC在基因表达上差异。使用MAS3.0系统分析差异基因所指示的各项生物学活性;实时定量PCR检测CD106+与CD106-的CV-MSC基因表达的差异;ELISA检测CD106+与CD106-的CV-MSC分泌PGE2能力的差异。(6)将CV-MSC传代至第九代，显微镜观察细胞形态的改变。流式细胞术检测其表型的变化。实时定量PCR检测其基因表达变化。用ELISA检测CD106+与CD106-的CV-MSC分泌PGE2能力的差异。将PHA刺激的人外周血单个核与第三代和第九代CV-MSC共培养，ELISA检测IFN-γ的分泌。(7)使用炎症细胞因子IFN-γ，TNF-α和IL-1β刺激CD106-CV-MSC和UC-MSC，实时定量PCR检测其中CD106+CV-MSC相关基因的变化，流式检测细胞表型的变化。
　　 结果:(1)相对于骨髓，脂肪和脐带来源的MSC，CV-MSC高表达CD106，而且高表达COX-2, IL-1α，IL-1β, IL-6和IL-8这几个免疫相关的基因。CV-MSC分泌PGE2的能力很强，可以能强烈得抑制PHA刺激的人外周血单个核细胞的IFN-γ的分泌。(2)在体外分离得到相对较纯的CD106+和CD106-的CV-MSC，两种细胞均具有典型的MSC形态。CD106+和CD106-的CV-MSC均具有向脂肪细胞和骨细胞分化的能力，但CD106-CV-MSC在体外具有更强的集落形成能力。(3) CD106+CV-MSC比CD106-CV-MSC能更加有效的抑制PHA刺激的外周血单个核和脐血CD4+T细胞的IFN-γ和TNF-α的分泌，并能有效地降低CD4+T细胞内IFN-γ，TNF-α，T-bet,IL-21和IL-22的表达; CD106+CV-MSC比CD106-CV-MSC略微更有效得提高CD4+T细胞中CD25+Foxp3+的Treg细胞的比例。(4) CD106+CV-MSC的培养上清比CD106-CV-MSC的培养上清能更有效地促进脐血CD34+的分化。(5)基因芯片结果显示，CD106+CV-MSC表达更多的免疫相关的基因，如COX-2，IL-1α，IL-1β，IL-6和IL-8;实时定量PCR验证了这些基因的变化。(6) CV-MSC在第九代比第三代表达的CD106下降，细胞形态发生改变，免疫调节功能和多个免疫相关基因表达下降。(7) TNF-α和IL-1β可以调节CD106-CV-MSC和UC-MSC表达CD106，COX-2，IL-1α，IL-1β， IL-6和IL-8，但IFN-γ只能调节CD106和IL-6。
　　 结论:CD106鉴别了CV-MSC中的一个具有很强免疫调节功能的亚群，CD106的表达与CV-MSC的免疫调节功能密切相关。TNF-α和IL-1β对CD106+CV-MSC相关的基因的表达有重要作用。

目录

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述：细胞因子对间充质干细胞的调节作用

附录一 主要仪器材料及试剂

附录二 主要溶液的配置

附录三 常见英文缩写和代码

附录四 在读期间发表文章、参加会议

致谢

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