猪附红细胞体ORF5的全基因合成、表达与鉴定1

摘要

目的:通过重叠区扩增法(PCR-based accurate synuhesis，PAS)，人工合成猪附红细胞体ORF5基因，并使其在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达。方法:根据GenBank注册的AJ504999的ORF5基因序列，选择大肠杆菌偏爱的密码子，设计并合成5对寡核苷酸片段，用PAS方法，人工合成ORF5基因。基因克隆入pMD18-T载体，经测序证实正确后，连接到表达载体PET-32a，获得重组表达质粒PET-32a/ORF5，导入大肠杆菌BL21(DE3)，在37°C，IPTG终浓度1mmol/L的条件下诱导表达，经SDS-PAGE分析，Western-blot鉴定，在35kDa附近出现目的片段。结果:ORF5基因能够在大肠杆菌中高效表达；通过生物信息学软件对其3D结构及蛋白功能等方面进行预测，预测结果表明该蛋白具有23个配基结合位点，6个α螺旋，胞浆外蛋白，没有信号肽，不存在糖基化位点。结论:ORF5基因能够在大肠杆菌中高效表达，推测其在猪附红细胞体蛋白的形成，附红细胞体的生物功能等方面有着重要作用。