不同构象DNA疫苗在体内外表达差异研究

摘要

本研究利用上述2个具有报告基因特性的质粒(pcDNA3.1-EGFP和pDRVISV1.0-Fluc)来分别模拟DNA疫苗，通过3种处理手段(新鲜制备、反复冻融、酶切)以构建不同构象形式的质粒，来研究不同超螺旋比例的DNA疫苗在体内外表达量的差异，从而为DNA疫苗特别是艾滋病疫苗临床前研究的质量控制标准提供实验依据。目的:研究DNA疫苗构象对体内和体外表达的影响.方法:分别构建绿色荧光蛋白表达质粒(pcDNA 3.1-EGFP)和萤火虫荧光素酶表达质粒(pDRVISV1.0-Fluc),对其存在的3种拓扑形式(包括超螺旋、线性、闭环切刻等)和反复冻融状态对表达效率的影响进行分析,前者用脂质体介导转染293Fr细胞,用流式细胞仪检测EGFP的表达情况;后者通过接种BALB/c小鼠,用活体成像技术监测荧光素酶的表达情况.结果:对pcDNA3.1-EGFP质粒,流式细胞仪检测其转染293FT细胞48h后显示,4种处理组的质粒表达EGFP的效率和荧光强度有所差异,依次为新鲜制备质粒(89.76％,2682.68)＞反复冻融处理质粒(76.35％,2313.48)＞闭环切刻质粒(68.45％,1245.95)＞线性质粒(38.28％,929.5).对pDRVISV1.0-Fluc质粒,采用小鼠活体成像技术持续观察接种后18d的体内荧光素酶的荧光信号强度情况,结果显示:接种后0.2d观察到荧光,之后强度持续开始增强,至第5d达到平台期,维持至18d.质粒各处理组的荧光强度组间有显著差异,依次为新鲜制备质粒(108.6)＞反复冻融处理质粒(108.4)＞线性质粒(108.3)＞切刻质粒(108.0).2种质粒不同构象的体内体外表达中,均是新鲜制备质粒的表达量最高,因其中超螺旋为其主要构象.结论:质粒中超螺旋比例高时其转染效率及表达量最高,提高超螺旋比例是DNA疫苗质量控制的关键.