SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测鸡PD-1和PD-L1 mRNA方法的建立

摘要

为建立鸡PD-1和PD-L1 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，根据GenBank中PD-1、PD-L1的基因序列，以鸡肌动蛋白(β-actin)基因为内参，设计特异性引物扩增目的基因片段。将三种目的基因克隆至pMD18-T载体上，经侧序鉴定，得到各自阳性克隆质粒，以三种阳性克隆质粒为标准品，进行1:10倍比稀释，以建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及敏感性、特异性、重复性试验。结果表明，当标准品稀释度为1×102～1 ×1010copies/μL时，三种基因的Ct值与浓度间具有良好的线性关系，相关系数R2均大于0.990，敏感性较好。熔解曲线分析表明，产物为特异性单峰且重复性较好。应用建立的方法对10只4周龄SPF雏鸡外周血单核细胞PD-1和PD-L1 mRNA的相对表达量进行检测，结果表明，虽然鸡PBMC中PD-1 mRNA的平均表达量约为152copies/μL，PD-L1 mRNA的平均表达量约为187copies/μL，2种目的基因都呈低水平表达，但其表达水平在本方法检测范围内，且重复性良好。本研究成功建立了敏感性高、特异性强、重复性好的鸡PD-1和PD-L1 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，研究结果为鸡PD-1和PD-L1的定量分析提供了技术平台。