通心络对大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的影响

摘要

目的：探讨通心络(Tongxinluo,TXL)对同型半胱氨酸(homocysteine,Hcv)诱导大鼠心肌微血管内皮细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress.ERS)致细胞凋亡的影响及其机制. 方法：采用植块法原代培养乳鼠心肌微血管内皮细胞,倒置显微镜观察细胞形态并通过CD31免疫荧光法对培养的大鼠心肌微血管内皮细胞进行辨别、鉴定.取2-4代生长良好的大鼠心肌微血管内皮细胞,采用免疫荧光法检测葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)表达以确定Hcv最佳作用时间.后续实验分为5组：空白对照组、Hcy诱导组(Hcy10mmol/L,10h)、Hcy+TXL组(Hcy lOmmol/L+TXL400μg/mL)、Hcy+LY294002组(Hcy10mmol/L+LY2940025μmol/L,LY294002为PI3K抑制剂)及Hcv+LY294002+TXL组(Hcy10mmol/L+LY2940025μmol/L+TXL400μg/mL).采用流式细胞仪检测大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡率,实时荧光定量反转录PCR(Real-Time Reverse Transcription PCR,RT-PCR)及Western blot法检测GRP78、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12(cvsteinyl aspartate specific proteinase-12,caspase-12)mRNA及蛋白表达,Western blot法检测磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylation of phosphatidylinositol3-kinase,p-PI3K)、总磷脂酰肌醇3-激酶(total phosphatidylinositol3-kinase,t-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylation of kinase B,p-Akt)及总的蛋白激酶B(total kinase B,t-Akt)蛋白表达. 结果：确定Hcy作用时间为10h.与空白对照组比较,Hcy诱导组细胞凋亡率(22.77％)升高,GRP78、CHOP和Caspase-12mRNA及蛋白表达升高,p-PI3K和p-Akt蛋白表达降低,p-PI3K/t-PI3K及p-Akt/t-Akt降低(P＜0.05,P＜0.01);与Hcv诱导组比较,Hcv+TXL组细胞凋亡率(10.17％)降低,GRP78、CHOP和Caspase-12mRNA及蛋白表达降低,p-PI3K和p-Akt蛋白表达升高,p-PB K/t-PBK及p-Akt/t-Akt升高(P＜0.05,P＜0.01);与Hcv+TXL组比较,Hcv+TXL+LY294002组细胞凋亡率(17.9％)升高,GRP78、CHOP和Caspase-12mRNA及蛋白表达升高,p-PI3K和p-Akt蛋白表达降低,p-PI3K/t-PI3K及p-Akt/t-Akt降低(P＜0.05,P＜0.01) 结论：通心络可抑制Hcy诱导的ERS致大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡,其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关.