活性共价化学标记-质谱分析蛋白质复合物局部微观结构

摘要

近年来质谱已经成为蛋白质结构分析表征的重要方法,具有灵敏度高、可分析复杂混合物、可高通量动态分析等特点.活性状态下,生物体中的赖氨酸通常带正电,对于稳定蛋白质结构、调控蛋白质功能具有至关重要的作用.建立了一种将活性二甲基化共价化学标记和质谱技术相结合的方法,系统考察了蛋白质内赖氨酸的局部微观环境.将这一方法应用在蓝细菌、红藻和菠菜的光系统Ⅱ(photosystemⅡ，PSⅡ)蛋白质复合物局部微观结构对比分析中，通过甲醛和氰基硼氢化钠对赖氨酸侧链上的伯胺进行还原二甲基化标记反应，位于蛋白质表面的“自由”赖氨酸更容易被标记，而位于蛋白质相互作用界面的赖氨酸由于氢键和静电相互作用等较难被标记。标记后赖氨酸电荷状态不变，仍然保持其原有生理结构和生物活性。以菠菜PSⅡ复合物为例，在进行高度标记（所有赖氨酸标记效率均大于85%）后仍然保持高放氧活性。在三个物种间，总共鉴定到121个标记效率不同的赖氨酸。物种间标记效率一致的赖氨酸主要集中于PSⅡ蛋白质复合物的lumen区域，并且位于与氧释放相关的蛋白质亚基(PsbB、PsbC、PsbD、Psb0)的相互作用界面上。通过活性二甲基标记结合质谱分析的方法考察膜蛋白质复合物内赖氨酸的局部微观环境，为深入了解进行光合作用的不同物种间PSⅡ蛋白质复合物上的保守和非保守结构信息提供了依据。