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产生人源化Alu RNA工程菌的构建和表达

摘要

目的:外源RNA导入细胞特异性上调或下调基因表达,目前外源RNA的制备方法主要有化学合成,体外转录,细胞提取.Alu DNA和Alu RNA是人基因组和转录组中最重要的成分,参与基因表达调节.建立工程菌制备基因工程人源Alu RNA(Alu RNA)的技术,所提取的RNA满足一般生物学实验要求. 方法和结果:将人Alu序列插入pET-28α质粒(pET),转化BL-21菌,探讨不同条件对Alu RNA产生的影响.用pET-Alu×8质粒转化BMBL-21(DE3)感受态细胞(简称DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导减弱细菌生长;用IPTG诱导2,4,6,8,10,12,14和16小时,用northern杂交检测Alu RNA的量,发现诱导4小时RNA产量最高;1,2,4,8,14拷贝的Alu序列插入pET,转化DE3菌,随拷贝数增加Alu RNA产量上升;pET-Alu×8DE3菌液,不加IPTG诱导,没有Alu RNA产生,0.1-0.4mg/ml IPTG诱导时,Alu RNA产量没有区别,偏离该浓度时,RNA产量略下降;34℃,37℃和40℃培养pET-Alu×8DE3菌液,IPTG诱导4小时,在37℃培养条件下,RNA产量最高;将pET-Alu×8质粒转化3种BL-21感受态细胞,包括DE3,BMBL21-DE3-pLysS(简称pLysS)和Trans BL21(简称TransBL),发现转化DE3感受态细胞后Alu RNA产量最高. 结论:本文中建立了基因工程制备Alu RNA的技术:pET-Alu×14质粒转化DE3菌,37℃培养至600nm OD1.0时,加入终浓度为0.2mg/ml IPTG诱导4小时,获得最高Alu RNA产量,纯Alu RNA在提取的RNA中的含量达15.8%,每100ml菌液纯Alu RNA产量平均为0.46mg.

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