NAD+/NADH循环再生型双重组菌耦合体系的初步研究

摘要

构建具备NAD+/NADh再生能力的双重组菌耦合体系(表达甲酸脱氢酶的E. Coli BL21(DE3)/pET 28a(+)-fdh和表达醇脱氢酶的E. Coli BL21(DE3)/pET 28a(+)-adh),分别研究了两者的培养条件、前者的高细胞密度培养以及后者的分离纯化。重组菌E. Coli BL21(DE3)/pET 28a(+)-fdh优化后的发酵培养基为:Na2hPO4·7h2O 13 g.L-1,NaCl 0.5 g.L-1L,Kh2PO4 3 g.L-1,Nh4Cl 3.5 g.L-1，MgSO4 0.2 g.L-1,葡萄糖10 g.L-1,微量元素2 ml.L-1。重组菌E. Coli BL21(DE3)/pET 28a(+)-fdh高密度培养研究发现,以葡萄糖浓度为指标的分批补料,发酵液的OD600值达到83,酶活为11.9 U.ml-1；而以pH为指标的ph-stat法葡萄糖流加方式补料,发酵液的菌体密度有所提高，OD600达到98,酶活为12.1 U.ml-1。重组菌E. Coli BL21(DE3)/pET 28a(+)-adh粗酶液经Ni-NTA Agarose亲和层析、Sephedex G-25 medium凝胶过滤和冷冻干燥得到纯酶Adh,比酶活提高5.62倍,为6.57 U.mg-1。