肺泡上皮细胞A549炎症模型的筛选及调补肺肾三法方药对NF-κB信号通路的影响(摘要)

摘要

目的:以TNF-a, LPS诱导A549细胞筛选并优化A549细胞体外炎症模型，观察其分泌炎症因子的情况以及对NF-xB, MAPK, JAK-STAT, PPAR信号通路中转录因子NF-xB,核转录因子激活蛋白-1、信号转导转录激活因子-3、过氧化物酶体增殖物激活受体活性的影响，筛选其靶通路，探讨调补肺肾三法(补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方)对A549细胞NF-κB信号通路的调控作用，为揭示调补肺肾三法阻抑COPD炎症反应的分子作用机制提供依据。rn 方法:1.筛选并优化A549细胞体外炎症模型MTT检测TNF-a不同浓度诱导A549细胞不同作用时间对细胞生长的影响;MTT检测LPS不同浓度不同作用时间对细胞生长的影响。2.含药血清制备。普通级日本大耳白兔96只随机分为正常对照组、补肺健脾组、补肺益肾组和益气滋肾组。分别用生理盐水、补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方灌胃，于第7次灌胃后1h腹主动脉采血，离心分离血清，过滤分装，56 C, 30min灭活后，-80℃保存所得含药血清。3.观察调补肺肾三法对信号通路NF-KB的影响。根据以上模型筛选结果，分组干预细胞:分为空白血清组、模型组、补肺益肾组、补肺健脾组、益气滋肾组，取上述相同指标进行测定.之后添加信号通路NF-xB抑制剂二硫氨基甲酸肤毗咯烷(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)组，EMSA检测A549中转录因子NF-xB的活性。rn 结果:1.筛选并优化A549细胞体外炎症模型。2.调补肺肾三法对NF-κB诱导A549细胞炎症模型的NF-KB信号通路的影响。首先，调补肺肾三法不同浓度含药血清对细胞A549生长的影响。与正常对照组相比，20%调补肺肾三法血清(补肺益肾组、补肺健脾组、益气滋肾组)OD值明显升高(p<0.01,p<0.05);与模型组相比，20%调补肺肾三法血清组OD值明显升高(p<0.01, p<0.05)，40%补肺健脾组OD值降低((p<0.05)，余浓度含药血清OD值变化无明显统计学意义(p>0.05)。其次，调补肺肾三法对A549细胞分泌IL-8,MMP-9,TNF-a的影响。与20%空白血清组比较，模型组、调补肺肾三法血清(补肺健脾组、补肺益肾组、益气滋肾组)及PDTC组诱导A549细胞24h时细胞因子IL-8, MMP-9, TNF-a分泌显著增多(p<0.01)。与20%模型组比较，益气滋肾组诱导A549细胞24h时IL-8分泌增多(p<0.05)补肺健脾组、补肺益肾组、益气滋肾组MMP-9分泌显著增多(p<0.01)，补肺益肾组、益气滋肾组TNF-a分泌增多(p<0.05, p<0.01)，补肺健脾组TNF-a分泌减少(p<0.05)。与40%空白血清组比较，模型组、调补肺肾三法血清(补肺健脾组、补肺益肾组、益气滋肾组)及PDTC组诱导A549细胞24h时IL-8分泌增多(p<0.01)，模型组、补肺益肾组、补肺健脾组MMP-9分泌增多(p<0.01)，模型组TNF-a分泌增多(p<0.01)。与40%模型组比较，调补肺肾三法血清(补肺健脾组、补肺益肾组、益气滋肾组)诱导A549细胞24h时TNF-a分泌显著减少(p<0.01);调补肺肾三法血清(补肺健脾组、补肺益肾组、益气滋肾组)及PDTC组诱导A549细胞24h时IL-8分泌减少(p<0.05 );益气滋肾组、PDTC组诱导A549细胞24h时MMP-9分泌减少(p<0.05, p<0.01)，补肺益肾、补肺健脾组MMP-9分泌有减少趋势，但无统计学意义(p>0.05 )。最后，调补肺肾三法及抑制剂PDTC含药血清对A549细胞NF-xB通路活性的影响与空白血清组相比，40%模型组血清(20ng/mL TNF-a)诱导A549细胞24h时转录因子NF-KB活性增强(p<0.05)。与模型组相比，40%调补肺肾三法血清(补肺健脾组、补肺益肾组、益气滋肾组)及PDTC组诱导A549细胞24h时转录因子NF-κB活性减弱有显著性差异(p<0.01)。与空白血清组相比，10%, 20%模型组诱导A549细胞24h时转录因子NF-xB活性有增强趋势，但无统计学意义(p>0.05 )，且与模型组相比，10%, 20%调补肺肾三方血清组及PDTC组转录因子NF-xB活性减弱无统计学意义(p>0.05 )。rn 结论：1.TNF-a可使A549细胞生长受到抑制，能够诱导细胞分泌IL-8,MMP-9等炎症因子，能够激活NF-xB, MAPK信号通路，可使用TNF-a诱导A549细胞作为A549细胞体外炎症模型。2.确立了优化TNF-a诱导A549细胞的条件，20ng/mL TNF-a诱导A549细胞24h作为细胞炎症模型是适宜的。3.LPS对A549细胞生长影响较小，对细胞分泌IL-6,IL-8,MMP-9等炎症因子及 NF-xB,MAPK,JAK-STAT,PPAR通路的活性的影响不显著，LPS诱导A549细胞不适于建立细胞炎症模型。4.调补肺肾三法(补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方)均可明显下调TNF-a诱导的A549细胞分泌炎症因子IL-8, MMP-9, TNF-a水平，减弱转录因子NF-xB的活性。调补肺肾三法调控NF-xB信号通路以阻抑炎症反应可能是其治疗COPD的分子机制之一，具体机制有待进一步深入研究。