LM23调控细胞周期蛋白CDKs在大鼠精子发生过程中具有重要作用

摘要

目的：借助本研究室建立的活体LM23基因沉默大鼠动物模型，制备LM23蛋白的合成肽多克隆抗体和生物信息学等方法，研究LM23蛋白的功能。rn 方法：利用互联网公共信息数据库PROSITE，Protfun server，PSORT server和BLAST等生物分析工具软件对LM23进行生物信息学分析。利用生物信息学方法分析选择LM23蛋白的多肽序列。应用Fmoc法化学合成大鼠LM23蛋白从N端数第274～291个氨基酸多肽，将纯化的LM23蛋白合成多肽与KLH交联，作为抗原免疫新西兰大耳白兔，获得LM23蛋白的多克隆抗体。利用LM23多克隆抗体研究LM23蛋白在大鼠睾丸中的表达定位情况。为了解LM23基因knockdown后是否会导致相关生精细胞发生凋亡，对LM23基因RNAi后大鼠睾丸生精细胞的凋亡状况进行TUNEL和Caspase 3抗体免疫组织化学研究。对LM23基因RNAi大鼠睾丸进行基因芯片研究，了解LM23基因knock down后差异表达的基因，并对差异表达基因进行进一步验证。利用CDK1、CDK2、CyclinA1等蛋白的抗体，进行Western blot和免疫组织化学实验，以研究LM23基因knock down大鼠中降调的细胞周期关键蛋白CDK2和CyclinA1，以及精子发生相关蛋白PIWIL2与LM23蛋白的关联。rn 结果：LM23蛋白拥有2个N-糖基化位点，7个蛋白激酶C磷酸化位点，5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，3个N-豆蔻酰化位点，2个酰胺化位点。LM23蛋白很可能位于细胞核中，这一点也与我们随后进行的LM23蛋白免疫组织化学定位研究的结果相一致。通过BLAST工具对LM23基因的同源基因进行比对分析，结果发现LM23基因与小鼠、人类的细胞周期相关基因speedy homolog A(Speedy)基因具有一定同源性。LM23蛋白可能参与蛋白翻译调节过程，是一种生长因子。另外，本研究利用CPHmodles神经网络进行同源建模，成功预测出LM23蛋白的三维立体结构图。通过化学Fmoc法分别合成大鼠LM23蛋白N端第274～291个氨基酸多肽，纯化后两种多肽的纯度都达到90％以上，符合免疫用抗原标准。应用大鼠睾丸组织切片进行LM23-18肽多克隆抗体的免疫组织化学研究，发现精母细胞有阳性颗粒反应，且存在于细胞核中。TUNEL研究发现，LM23基因RNAi大鼠睾丸有大量精母细胞发生凋亡。免疫组织化学研究显示，与对照相比LM23基因RNAi大鼠睾丸生精细胞Caspase 3分子的表达量显著增加，提示LM23基因knock down导致大量精母细胞发生凋亡可能是通过Caspase 3途径实现的。LM23基因RNAi大鼠睾丸基因芯片分析结果发现，LM23基因knock down大鼠睾丸的细胞周期关键基因CDK2和CyclinA1的表达量显著低于对照组。Western blot和免疫组织化学研究结果证实，CDK1、CDK2、CyclinA1等蛋白在LM23基因RNAi大鼠睾丸的表达量显著低于对照。rn 结论：LM23属于Speedy/Ringo家族，通过激活Cdk1和Cdk2可能参与了精子发生过程中的细胞周期调控并且具有抑制生精细胞凋亡的作用。