24-脱氢胆固醇还原酶拓扑空间结构研究用融合蛋白真核表达载体的构建与表达

摘要

目的：构建两种在哺乳动物细胞中表达24-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)/GFP及DHCR24/REP融合蛋白的质粒，即在DHCR24的N端融合了红色荧光蛋白(RFP)的pDsred-C1-DHCR24表达载体和在DHCR24的C端融合绿色荧光蛋白(GFP)的pEGFP-N1-DHCR24表达载体。将两种质粒共转染至小鼠成神经瘤细胞株N2A中，观察DHCR24融合蛋白的表达，确定其细胞定位，为进一步研究其拓扑空间结构奠定基础。方法：从人肝癌细胞株HepG2中分别扩增出DHCR24的全长cDNA序列，扩增产物进行T-A克隆，经酶切、DNA测序鉴定正确后，将DHCR24的cDNA片段分别酶切后连接入pEGFP-N1-DHCR24和pDsred-Cl-DHCR24两种真核表达载体。随后用这两种载体转染N2A细胞。通过免疫细胞化学荧光确定其亚细胞定位。结果：重组质粒经酶切和测序鉴定正确并在N2A细胞中高量表达，免疫荧光结果证明DHCR24分布于内质网中。结论：成功构建了两种表达DHCR24/荧光蛋白的融合蛋白的质粒。为研究DHCR24在内质网的拓扑空间结构及其抗内质网应激分子机制提供了一种重要的工具。