高性能红色cAMP荧光探针及其应用

摘要

本发明属于生物检测领域。尤其涉及一种高性能红色cAMP（环磷酸腺苷）荧光探针，及其在活细胞中检测cAMP浓度的应用。本发明与绿色cAMP探针相比，R‑Flamp1m是红色探针，而红色探针能够与已有的大量绿色探针或者蓝光敏感的工具蛋白联合使用，可同时进行双色成像或者进行光学控制/荧光成像联用；在37℃培养细胞中，R‑Flamp1m的荧光亮度是现有红色cAMP探针Pink Flamindo及R‑FlincA的10倍以上，且具有更大的动态范围(ΔF/F0~5)，即具有更高的检测灵敏度。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域。尤其涉及一种高性能红色cAMP（环磷酸腺苷）荧光探针，及其在活细胞中检测cAMP浓度的应用。

背景技术

环磷酸腺苷(cAMP)，是目前最大药物靶标G蛋白偶联受体(GPCR)家族的下游信使分子，细胞及活体水平的cAMP荧光成像是GPCR信号通路的基础研究和药物开发的重要方向。活细胞中cAMP荧光成像，是将cAMP荧光探针表达在细胞中，然后利用荧光显微镜检测探针荧光的强度变化。荧光探针是cAMP荧光成像分析的关键。cAMP荧光探针主要分为基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针及基于单个荧光蛋白的探针，后者动态范围较前者大且使用简单。

近几年，国际上知名实验室利用不同荧光蛋白、不同cAMP感应模块及不同的融合位点，开发了不同性能和光谱的cAMP单荧光蛋白探针（见表1），包括Tetsuya Kitaguchi 博士开发的Flamindo/Flamindo2/Pink Flamindo 探针、Anne Marie Quinn 博士开发的cADDis/Red cADDis 探针、Kazuki Horikawa 博士开发的R-FlincA探针及Justin Blau 博士开发的cAMPr 探针。

表1 不同性能和光谱的cAMP单荧光蛋白探针汇总。

目前，基于单个荧光蛋白的cAMP探针分为绿色和红色2小类，前者主要有Flamindo2、cADDis及cAMPr，后者主要有Pink Flamindo、Red cADDis及R-FlincA。对于绿色cAMP探针，我们已开发更高性能的探针G-Flamp1 (201911251920.X和202010354936.X)。相较于短波长的绿色探针，长波长的红色探针具有诸多优点：（1）红色探针能够与已有的大量绿色探针或者蓝光敏感的工具蛋白联合使用；（2）红色探针具有更低的荧光背景干扰、更小的光毒性和更深的组织穿透能力。但是，现有的红色探针具有以下不足：（1）在37°C培养哺乳动物细胞中亮度很低(如Pink Flamindo/R-FlincA)，不利于细胞的定位和神经元树突等微小细胞结构的观察；（2）在37°C培养哺乳动物细胞中动态范围（荧光亮度变化幅度ΔF/F0）很小(如Pink Flamindo/R-FlincA)，严重影响检测灵敏度； (3) 有些探针表达差，如R-FlincA在哺乳动物细胞中较长时间表达会形成斑点。

综上所述，本发明开发高性能红色cAMP荧光探针，提高其在实际应用中的亮度和动态范围，对于提高探测灵敏度具有重要意义。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种高性能红色cAMP（环磷酸腺苷）荧光探针R-Flamp1m，及其在活细胞中检测cAMP浓度的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明提供了一种cAMP荧光探针R-Flamp1m具有氨基酸序列SEQ ID NO:1。

本发明所述的R-Flamp1m具有如式Ⅰ所示结构：

His-mApple-N—连接肽1—mEpacl—连接肽2—mApple-C（式Ⅰ）。

其中，

所述His 为His标签(即Histag)，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

所述mApple-N的氨基酸序列为 SEQ ID NO:3。

所述连接肽1（linker1）的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

所述mEpacl的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

所述连接肽2（linker2）的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。

所述mApple-C的氨基酸序列为SEQ ID NO:7。

作为本发明的优选方案，所述的氨基酸序列还包括经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与所述的氨基酸序列功能相同或者相似的氨基酸序列；所述的氨基酸序列为至少具有80%同源性的氨基酸序列。

本发明所述的cAMP荧光探针R-Flamp1m在活细胞和动物活体中的应用，具体为用于成像检测方法，尤其是双光子成像方法。

进一步的，本发明所述的cAMP荧光探针R-Flamp1m可以用于活动物体的cAMP信号检测。

进一步的，本发明所述的cAMP荧光探针R-Flamp1m可以用于HEK293T细胞中cAMP浓度检测。

进一步的，本发明所述的cAMP荧光探针R-Flamp1m可以用于溶液中cAMP浓度检测。

本发明的有益效果。

本发明的探针为红色cAMP探针R-Flamp1m，其在pink Flamindo基础上优化。发明人开发的R-Flamp1m探针，37℃生理温度培养细胞中，R-Flamp1m在560 nm单光子激发下，动态范围（ΔF/F0）约为5，在1000 nm双光子激发下，动态范围（ΔF/F0）约为8；R-Flamp1m最适激发波长约560 nm，最大发射波长约600 nm，从表1可知数据可见，R-Flamp1m是目前动态范围最大的红色cAMP探针。

相较于目前已有的荧光探针，本发明中的R-Flamp1m有以下优点：（1）与绿色cAMP探针相比，R-Flamp1m是红色探针，而红色探针能够与已有的大量绿色探针或者蓝光敏感的工具蛋白联合使用，可同时进行双色成像或者进行光学控制/荧光成像联用；（2）在37℃培养细胞中，R-Flamp1m的荧光亮度是现有红色cAMP探针Pink Flamindo及R-FlincA的10倍以上，且具有更大的动态范围(ΔF/F0 ~5)，即具有更高的检测灵敏度。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1. R-Flamp1m的结构设计示意图。

图2.纯化R-Flamp1m探针的荧光光谱和亲和力。

图3. 相同转染浓度和相同成像条件下，Pink-Flamindo、R-FlincA和R-Flamp1m在Hek293T细胞中的亮度比较。

图4.单光子激发下，不同探针在HEK293T细胞中的响应。

图5.双光子激发下，R-Flamp1m探针在HEK293T细胞中的响应。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细的描述。

本实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。

参照图1-5所示，为本发明提供的较佳实施例。

下面结合具体实施方式对本发明做详细的说明。

本发明公开的cAMP荧光探针R-Flamp1m，及其作为红色荧光探针在活细胞和动物活体中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容范围内对本发明所述的方法和应用进行改动或适当改变与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所用术语“荧光探针”是指与荧光蛋白相融合的对环境cAMP敏感的多肽，所述对环境中cAMP敏感的多肽具体可以是mEpac1蛋白，利用mEpac1中特异性的cAMP结合结构域与cAMP结合后产生的构象变化引起荧光蛋白的构象变化，从而导致产生的荧光发生改变，通过不同cAMP浓度下测定的荧光蛋白的荧光来绘制标准曲线，进而用于检测并分析细胞内cAMP的存在水平。

本发明提供了一种cAMP荧光探针R-Flamp1m 包括：对cAMP敏感的蛋白结构域和红色荧光蛋白；R-Flamp1m氨基酸序列见SEQ ID NO:1，R-Flamp1m的结构设计示意图见图1，其中，氨基酸序列中氨基酸序列号1-37为His标签(His tag) 部分, 38-188为荧光蛋白mApple的氨基端部分，189-191为连接肽1，192-340为感应模块部分mEpac1(205-353)，341-344为连接肽2，345-428为红色荧光蛋白mApple的羧基端部分。

本发明所述的cAMP荧光探针的检测方法，包括：

（1）以能够结合cAMP的mEpac1为感应结构域，与mApple荧光蛋白通过图1所示方式连接，经过若干氨基酸突变，即得到R-Flamp1m探针。

（2）将R-Flamp1m探针表达在细菌中，室温培养3天收集菌体，在pH=7.2的HEPES缓冲液(含150 mM KCl 及 50 mM HEPES)中超声破碎，利用HisPur Cobalt Resin（购自皮尔斯公司）纯化探针，并通过Econo-Pac 10DG脱盐柱（购自美国Bio-Rad公司）将探针溶解于在pH=7.2的HEPES缓冲液中，用BCA试剂盒（购自美国Thermo scientific公司）测定探针浓度；取2μM 探针溶液，利用多功能酶标仪Infinite M1000 PRO检测探针对饱和浓度cAMP(500μM)的响应，可见其信号增加19倍，具体结果见图2，其中（A）从细菌中纯化的R-Flamp1m探针稀释在pH 7.2的HEPES溶液中 (终浓度为2μM)，然后加入饱和浓度cAMP（500μM）；其荧光激发和发射光谱如图示意，虚线为激发谱，实线为发射谱；（B）2 μM 纯化探针与不同浓度cAMP或者cGMP混合，其荧光变化如图所示，由曲线可知，R-Flamp1m与cAMP亲和力约2μM，与cGMP亲和力约35μM。然而Pink Flamindo对cAMP/cGMP亲和力分别为3.2 μM /22μM。由此可见，本发明的荧光探针对cAMP 亲和有所提高，更加适合低浓度cAMP的检测；另一方面，对cGMP亲和力有所降低，可见本发明的荧光探针的特异性更好。

（3）R-Flamp1m HEK293T细胞需培养在玻璃底的培养皿中，培养基为含10%胎牛血清和1% penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5%。细胞密度为60%左右时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染相同质量的红色探针Pink-Flamindo、R-FlincA及R-Flamp1m的质粒。约24小时后，相同成像条件（激发波长、发射波长、激发光强度和成像时间等均相同）下，Pink-Flamindo、R-FlincA及R-Flamp1m在Hek293T细胞中的亮度，具体结果见图3，其中（A）为R-Flamp1m的细胞成像图；（B）为Pink-Flamindo的细胞成像图；（C）为R-FlincA的细胞成像图；（D）为A/B/C图中细胞亮度平均值的归一化柱状图。

（4）R-Flamp1m HEK293T细胞需培养在玻璃底的培养皿中，培养基为含10%胎牛血清和1% penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5%。细胞密度为60%左右时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染cAMPr、Flamindo2、G-Flamp1、Pink-Flamindo、R-FlincA及R-Flamp1m。过夜培养后，用不含血清和酚红的培养基（购自GIBCO公司）饥饿细胞2到4小时，将培养基换为无色透明的live cell imaging buffer，采用本实验室自行搭建的IX83单光子荧光显微镜（R-Flamp1m激发波长560 nm左右，最大发射波长600 nm左右）或商业化双光子（R-Flamp1m激发波长1000 nm左右，最大发射波长600 nm左右）显微镜进行成像分析。成像频率为15 s/scan，在第十帧加入Forskolin（购自碧云天生物技术公司），Forskolin终浓度为60 μM（例：培养皿中有500微升live cell imaging buffer，将4微升12mM的母液溶于300微升live cell imaging buffer中，第十帧时将稀释好的300微升Forskolin溶液滴入正在成像的细胞皿中）。Forskolin刺激后，细胞中cAMPr、Flamindo2、G-Flamp1、Pink-Flamindo、R-FlincA及R-Flamp1m荧光强度的变化，见图4，其中，（A）和（B）为利用Lipofectamine转染HEK293T细胞含cAMPr、Flamindo2、Pink-Flamindo、R-FlincA探针的质粒，过夜培养后，用不含酚红及血清的DMEM细胞培养液饥饿4小时后，用60 μMForskolin刺激后荧光亮度变化；（C）为R-Flamp1m和阴性对照探针R-Flamp1m R279E的响应；激发波长为560nm ± 20 nm；曲线数据表示：平均值±标准差，标尺：100μm。

利用Lipofectamine转染HEK细胞含R-Flamp1m探针的质粒，过夜培养后，用不含酚红及血清的DMEM细胞培养液饥饿4小时后，双光子激发波长为1000 nm条件下，用60 μMForskolin刺激后荧光亮度变化，结果见图5，曲线数据表示：平均值±标准差，标尺：100 μm。

至此，完成了哺乳动物细胞内cAMP浓度变化的荧光成像步骤。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院深圳先进技术研究院

<120> 高性能红色cAMP荧光探针及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 428

<212> PRT

<213> cAMP荧光探针R-Flamp1m(428)

<400> 1

Met Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Met Gly Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ala Pro

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ser Met Leu Val Ser Leu Gly Gly Gly Ala Ala Met

35 40 45

Ala Ile Ile Leu Gly Pro Met Ala Pro Leu Val His Met Gly Gly Ser

50 55 60

Val Ala Gly His Gly Pro Gly Ile Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Pro

65 70 75 80

Thr Gly Ala Pro Gly Thr Ala Leu Leu Leu Val Thr Leu Gly Gly Pro

85 90 95

Leu Pro Pro Ala Thr Ala Ile Leu Ser Pro Gly Pro Met Thr Gly Ser

100 105 110

Leu Ala Pro Ile Leu His Pro Ala Ala Ile Pro Ala Thr Pro Leu Gly

115 120 125

Ser Pro Pro Gly Gly Pro Ala Thr Gly Ala Val Met Ala Pro Gly Ala

130 135 140

Gly Gly Ile Ile His Val Ala Gly Ala Ser Ser Leu Gly Ala Gly Thr

145 150 155 160

Pro Ile Thr Leu Val Leu Leu Ala Gly Thr Ala Pro Pro Pro Ala Gly

165 170 175

Pro Val Met Gly Leu Leu Thr Met Gly Thr Gly Gly Thr Ala Ala Pro

180 185 190

Pro Leu Leu Ser Gly Ala Gly Pro Ala Ala Leu Leu Thr Val Ala Leu

195 200 205

Ala Leu Pro Pro Gly Gly Ala Thr Ala Gly Gly Leu Ala Leu Ile Pro

210 215 220

Gly Gly Leu Leu His Ile Leu Ala Val Ala His Leu Ser Ala Ser Val

225 230 235 240

Leu Ala Gly Leu Ala Ala Val Leu Leu Pro Gly Pro His Ser Leu Ala

245 250 255

Gly Thr Val Leu Pro Ser Gly Gly Ala Leu Gly Thr Ser Thr Thr Ile

260 265 270

Ile Thr Leu Gly Ser Val Ala Val Val Thr His Gly Leu Gly Leu Val

275 280 285

Thr Thr Leu His Gly Gly Ala Ala Pro Gly Gly Leu Ala Leu Val Ala

290 295 300

Ala Ala Pro Ala Ala Ala Thr Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ala Cys His

305 310 315 320

Pro Leu Ala Val Ala Leu Gly Ala Pro Ala Ala Ile Ile Leu Ala Val

325 330 335

Gly Pro Leu Val Gly Thr Val Ala Gly Met Met Thr Pro Gly Ala Gly

340 345 350

Ala Leu Leu Ser Gly Ile Leu Leu Ala Leu Ala Leu Leu Ala Gly Gly

355 360 365

His Thr Ala Cys Leu Val Leu Thr Thr Thr Leu Ala Leu Leu Pro Val

370 375 380

Gly Leu Pro Gly Ala Thr Ile Val Ala Ile Leu Leu Ala Ile Val Ser

385 390 395 400

His Ala Gly Ala Thr Thr Ile Val Gly Gly Cys Gly Ala Ala Gly Ala

405 410 415

Ala His Ser Thr Gly Gly Met Ala Gly Leu Thr Leu

420 425

<210> 2

<211> 37

<212> PRT

<213> Histag(37)

<400> 2

Met Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Met Gly Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ala Pro

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ser

35

<210> 3

<211> 151

<212> PRT

<213> mApple-N(151)

<400> 3

Met Leu Val Ser Leu Gly Gly Gly Ala Ala Met Ala Ile Ile Leu Gly

1 5 10 15

Pro Met Ala Pro Leu Val His Met Gly Gly Ser Val Ala Gly His Gly

20 25 30

Pro Gly Ile Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Pro Thr Gly Ala Pro Gly

35 40 45

Thr Ala Leu Leu Leu Val Thr Leu Gly Gly Pro Leu Pro Pro Ala Thr

50 55 60

Ala Ile Leu Ser Pro Gly Pro Met Thr Gly Ser Leu Ala Pro Ile Leu

65 70 75 80

His Pro Ala Ala Ile Pro Ala Thr Pro Leu Gly Ser Pro Pro Gly Gly

85 90 95

Pro Ala Thr Gly Ala Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Gly Ile Ile His

100 105 110

Val Ala Gly Ala Ser Ser Leu Gly Ala Gly Thr Pro Ile Thr Leu Val

115 120 125

Leu Leu Ala Gly Thr Ala Pro Pro Pro Ala Gly Pro Val Met Gly Leu

130 135 140

Leu Thr Met Gly Thr Gly Gly

145 150

<210> 4

<211> 3

<212> PRT

<213> linker1(3)

<400> 4

Thr Ala Ala

1

<210> 5

<211> 149

<212> PRT

<213> mEpacl(149)

<400> 5

Pro Pro Leu Leu Ser Gly Ala Gly Pro Ala Ala Leu Leu Thr Val Ala

1 5 10 15

Leu Ala Leu Pro Pro Gly Gly Ala Thr Ala Gly Gly Leu Ala Leu Ile

20 25 30

Pro Gly Gly Leu Leu His Ile Leu Ala Val Ala His Leu Ser Ala Ser

35 40 45

Val Leu Ala Gly Leu Ala Ala Val Leu Leu Pro Gly Pro His Ser Leu

50 55 60

Ala Gly Thr Val Leu Pro Ser Gly Gly Ala Leu Gly Thr Ser Thr Thr

65 70 75 80

Ile Ile Thr Leu Gly Ser Val Ala Val Val Thr His Gly Leu Gly Leu

85 90 95

Val Thr Thr Leu His Gly Gly Ala Ala Pro Gly Gly Leu Ala Leu Val

100 105 110

Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Thr Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ala Cys

115 120 125

His Pro Leu Ala Val Ala Leu Gly Ala Pro Ala Ala Ile Ile Leu Ala

130 135 140

Val Gly Pro Leu Val

145

<210> 6

<211> 4

<212> PRT

<213> linker2(4)

<400> 6

Gly Thr Val Ala

1

<210> 7

<211> 84

<212> PRT

<213> mApple-C(84)

<400> 7

Gly Met Met Thr Pro Gly Ala Gly Ala Leu Leu Ser Gly Ile Leu Leu

1 5 10 15

Ala Leu Ala Leu Leu Ala Gly Gly His Thr Ala Cys Leu Val Leu Thr

20 25 30

Thr Thr Leu Ala Leu Leu Pro Val Gly Leu Pro Gly Ala Thr Ile Val

35 40 45

Ala Ile Leu Leu Ala Ile Val Ser His Ala Gly Ala Thr Thr Ile Val

50 55 60

Gly Gly Cys Gly Ala Ala Gly Ala Ala His Ser Thr Gly Gly Met Ala

65 70 75 80

Gly Leu Thr Leu