金钗石斛总生物碱及其提取方法和在心脑血管疾病中的应用

摘要

本发明公开了一种金钗石斛总生物碱及其提取方法和在心脑血管疾病中的应用，提取方法包括：将金钗石斛的茎进行预处理，得到粉末；采用70wt％～80wt％酸性乙醇对所述粉末按照料液比为1:8～1:12进行回流提取，且浓缩得到浸膏；采用酸对所述浸膏进行溶解，后使用石油醚萃取，得到石油醚层和水层；将所得水层的pH值调节至9～10后采用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯层；将乙酸乙酯层进行浓缩干燥，即得所述金钗石斛总生物碱；金钗石斛总生物碱纯度高达65％，对阿尔茨海默病具有一定的改善作用。

说明书

技术领域

本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种金钗石斛总生物碱及其提取方法和在心脑血管疾病中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。根据《道藏》的记载，金钗石斛位于中国九大仙草之首，能调节人体免疫能力，滋阴补虚、补五脏、通过提高人体精血、津液的浓度，促进血液循环，调节神经内分泌系统，营养心肌，补五脏，改变血液粘稠度，减轻由于心脏的疾患对其它脏器的影响，缓解心脑血管疾病。

AD的主要病理学特征是氧化应激损伤、β-淀粉样肽(β-Amyloid,Aβ)蛋白沉积、Tau蛋白过度磷酸化、内质网应激、自噬、肠道菌群紊乱等，各种机制之间相互联系，相互促进，使得AD患者病情不断恶化。为了研究AD的发病机制，寻求有效的治疗措施，已经建立了多种AD模型，其中自发性的快速衰老小鼠(senescence accelerated mouse prone,SAMP)模型和抗快速老化小鼠(anti-senescence mouse-prone,SAMR)得到了广泛的应用和认可。国内外对AD的研究方兴未艾，对防治AD药物研究的投入更是数以千亿计。然而，迄今为止的治疗药物主要是通过作用于不同的神经递质，长期临床用药表明，这些药物均为对症治疗，可以改善认知和记忆障碍，但没有一种药物能够有效阻止或者延缓阿尔茨海默病病情的进展。

中医药是我国医药卫生的宝贵资源，从中草药资源中寻找安全有效的预防或延缓AD进程的药物不仅具有科学依据，也具有现实意义。金钗石斛主要含有生物碱类、多糖类、黄酮类、甾体糖苷类、香豆素类及酚类等多种活性成分，其中金钗石斛总生物碱(Dendrobium nobile Lindl.alkaloids,DNLA)是金钗石斛的主要活性成分之一，因此选取了金钗石斛总生物碱进行防治阿尔兹海默症的研究。

然后现有金钗石斛中生物碱的提取一般采用大量有机溶剂进行萃取，如二氯甲烷、三氯甲烷；由于这些有机溶剂普遍存在毒性高的特点，因此不利于药物的工业化生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有金钗石斛中生物碱的提取采用大量的有毒有机溶剂进行萃取，不利于药物的工业化生产。

本发明在于一种金钗石斛总生物碱的提取方法，包括：

将金钗石斛的茎进行预处理，得到粉末；

采用70wt％～80wt％酸性乙醇对所述粉末按照料液比为1:8～1:12进行回流提取，且浓缩得到浸膏；

采用酸对所述浸膏进行溶解，后使用石油醚萃取，得到石油醚层和水层；将所得水层的pH值调节至9～10后采用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯层；将乙酸乙酯层进行浓缩干燥，即得所述金钗石斛总生物碱。

作为一种可能的设计，所述酸性乙醇的pH值为3～4。

作为一种可能的设计，所述回流提取的温度为60℃～100℃，优选80℃～100℃，更优选90℃。

作为一种可能的设计，在所述采用酸对所述浸膏进行溶解中，所述酸包括盐酸和/或硫酸。

作为一种可能的设计，pH值调节至9～10中采用饱和氢氧化钠溶液或浓氨水。

作为一种可能的设计，所述预处理包括依次进行的干燥、粉碎、过筛以及称重，其中过筛中筛网的目数为50目。

作为一种可能的设计，所述酸性乙醇的质量百分数为75wt％～80wt％。

本发明的有益效果为：

1.本发明通过先采用石油醚萃取，后采用乙酸乙酯对水层进行萃取，最后将两者萃取得到的液相进行混合干燥即可，明显降低了毒性，因此可用于大规模工业化生产；并且所得金钗石斛总生物碱中总生物碱的纯度可达65％及以上。

2.本发明提取得到的金钗石斛总生物碱对心脑血管疾病具有良好的治疗或改善效果，特别是阿尔茨海默病。

3.金钗石斛总生物碱的提取方法具有易于控制、制备简单，便于大规模生产和临床使用的特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：

图1为本发明实施例中各组小鼠存活率统计图；

图2为本发明实施例中各组小鼠体重统计图；

图3为本发明实施例中各组小鼠Y迷宫检测自发活动交替正确率图；

图4为本发明实施例中各组小鼠新物体识别实验探索率图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

由于阿尔茨海默病是一种起病隐匿的进行性发展的神经退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。再由于中医药是我国医药卫生的宝贵资源，从中草药资源中寻找安全有效的预防或延缓AD进程的药物不仅具有科学依据，也具有现实意义。

基于上述原因，本发明的发明人从中药方面着手来治疗阿尔茨海默病，其中发明人选定金钗石斛，探讨金钗石斛总生物碱在治疗阿尔茨海默病中的效果。

本发明的发明人发现采用石油醚和乙酸乙酯相结合的方式，不仅能够得到总生物碱纯度较高的金钗石斛总生物碱，而且明显降低了金钗石斛总生物碱的毒性，可用于大规模工业化生产。

金钗石斛总生物碱的具体提取方法如下：

S1.将金钗石斛的茎进行预处理，得到粉末；

S2.采用70wt％～80wt％酸性乙醇对所述粉末按照料液比为1:8～1:12进行回流提取，且浓缩得到浸膏；

S3.采用酸对所述浸膏进行溶解，后使用石油醚萃取，得到石油醚层和水层；将所得水层的pH值调节至9～10后采用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯层；将乙酸乙酯层进行浓缩干燥，即得所述金钗石斛总生物碱。

在步骤S1中预处理主要包括依次进行的干燥、粉碎、过筛以及称重，其中过筛中使用的筛网目数一般为50目；该步骤中所涉及使用的设备为本领域中常用的设备，此处不详细阐述。

步骤S2中，所述“酸性乙醇”是指用酸对乙醇进行pH调节所得的混合物，其中，酸一般为盐酸和/或硫酸。本步骤中酸性乙醇中乙醇的质量分数为70wt％～80wt％，例如：70wt％、72wt％、75wt％、78wt％以及80wt％等等。

步骤S2中，所述“料液比”是指粉末的质量和酸性乙醇的体积之比，料液比可优选1：10。回流提取的时间一般为2～3小时。回流提取的温度一般为60～100℃，例如：60℃、70℃、80℃、90℃以及100℃。

在步骤S3中，酸一般为常见的酸性溶液，如盐酸，硫酸等等。酸的浓度一般为4wt％～5wt％。水层pH值调节过程中所使用的调节剂一般为碱性溶液，例如：饱和氢氧化钠溶液、浓氨水等等。

在步骤S3中，。乙酸乙酯萃取的次数一般为5～8次。

本发明中，提取得到的金钗石斛总生物碱中总生物碱的纯度大于或等于65％。金钗石斛总生物碱中含有的单体化合物包括石斛碱(Dendrobine,C

本发明制备得到的金钗石斛总生物碱可用于治疗或改善心脑血管疾病，主要是认知缺陷，心脑血管疾病包括但不限于阿尔兹海默症，也作为治疗心脑血管疾病药物中的有效成分。

本发明中，所述阿尔兹海默症包括但不限于记忆障碍、失语、失用、失认表现为特征。

本发明中，所述阿尔兹海默症包括但不限于视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。

实施例1

本实施例公开了一种金钗石斛总生物碱的提取方法，包括以下步骤：

S1.称取金钗石斛干燥茎依次进行粉碎和过筛，然后称取10kg粉末；

S2.向粉末中加入75wt％的酸性乙醇浸泡药材过夜后，按照1:8的料液比混合，在60℃下回流提取2次，每次提取3h，然后按照1:12的料液比混合，在80℃下回流提取2次，每次提取2h，过滤，合并滤液，浓缩滤液干燥，得到金钗石斛提取物浸膏；

S3.用4wt％盐酸对金钗石斛提取物浸膏进行溶解，过滤，除掉不溶物；

S4.以石油醚萃取后分离得到石油醚层和水层，水层再用饱和氢氧化钠溶液调节pH至9，后采用乙酸乙酯进行萃取6次，合并每次萃取得到的乙酸乙酯层，然后进行浓缩，得到金钗石斛总生物碱浸膏。

对实施例1制备得到的金钗石斛总生物碱浸膏中生物碱含量的测定

1.酸性染料比色测定金钗石斛总生物碱含量

1.1标准曲线的制备：精密称取石斛碱对照品0.50mg，置50mL容量瓶中，少量三氯甲烷充分溶解后定容至刻度；用移液枪分别取50、150、200、300、400μL于1.5mL具塞玻璃试管中，分别加适量三氯甲烷补至500μL体积；加入pH＝4.5的缓冲溶液250μL和0.04％溴甲酚绿溶液100μL，剧烈振摇3min，静置30min，分层，取下层三氯甲烷液100μL于96孔板，加0.01mol/L NaOH-无水乙醇溶液20μL，摇匀，取三氯甲烷溶液，同法操作，作为空白对照；采用酶标仪于620nm处测定吸光度。以石斛碱浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线得回归方程，A＝20.780C+0.072(R

1.2金钗石斛总生物碱样品的测定：称取金钗石斛总生物碱样品0.50mg，置5mL容量瓶中，少量三氯甲烷完全溶解后定容至刻度；移液枪移取200μL于1.5mL具塞玻璃试管中，加三氯甲烷300μL，摇匀，作为供试品溶液，其余操作按1.1进行，测得金钗石斛总生物碱含量为66.8％。由此可知，本实施例制备的金钗石斛总生物碱浸膏中总生物碱的含量高，大于65％。

实施例2

金钗石斛总生物碱对AD模型的治疗作用

本实施例中所使用金钗石斛总生物碱来源：实施例1制备得到的金钗石斛总生物碱浸膏。

1.实验动物

雄性6月龄SAMP8小鼠与同月龄SAMR1小鼠，无特定病原体(specefic pathogenfree,SPF级)。

2.药物

将前述制备得到的金钗石斛总生物碱浸膏溶解于1％吐温80，每天灌胃给药1次。

3.实验方法

将4月龄雄性SAMP8(n＝64)和同月龄SAMR1(n＝13)小鼠随机分为5组：SAMR1对照组(n＝13)、SAMP8模型组(n＝16)、SAMP8+DNLA 20mg/kg(n＝16)、SAMP8+DNLA 40mg/kg(n＝16)和阳性药二甲双胍组(Met,80mg/kg)(n＝16)。每日一次灌胃DNLA和Met，连续给药6个月。给药结束后，统计成活率、体重变化和进行行为学实验。

其中，成活率如图1所示，由图1可知，采用不同剂量的DNLA灌胃后，小鼠的成活率和SAMP8模型组的成活率相当。

体重变化情况如图2所示，由图2可知，采用不同剂量的DNLA灌胃后，小鼠的体重变化不明显。

行为学检测—Y迷宫

准备适应阶段：在实验前7天，让小鼠熟悉适应放置Y迷宫房间的气味和环境。准备酒精喷雾瓶和纸巾并确保Y迷宫在每次清洁后完全干燥。在实验前1h将小鼠提前置于行为学实验室内适应环境。测试阶段：给Y迷宫A、B和C的臂标上标签。将小鼠面朝迷宫中心放入标记为A的手臂远端，手持鼠尾，从起始臂轻轻放入。每只小鼠在Y迷宫中探索10min，用固定于Y迷宫上方的红外线摄像机监测并记录小鼠在Y迷宫三个手臂的活动顺序和在各手臂的运动总数。在下一只小鼠进入Y迷宫之前，用酒精清洁所有的墙壁和地板。小鼠身体完全进入臂内为一次标准的进入，连续进入三个手臂定义为一次成功的自发交替行为。交替正确率(％)＝正确选择次数/(总穿臂次数-2)×100％。

Y迷宫检测结果如图3所示，由图3可知，采用不同剂量的DNLA灌胃后，小鼠的Y迷宫交替正确率明显高于模型组，并且和阳性药二甲双胍组相当，说明DNLA能够在一定程度上改善AD。

行为学检测—新物体识别实验

第一天(习惯阶段)：将小鼠依次放在空旷的NOR反应箱中熟悉环境5min。第二天(训练阶段)：将两个完全相同的A物体固定于NOR反应箱,将小鼠从NOR反应箱一角放入，在NOR反应箱中自由探索10min。第三天(识别测试)：用B物体代替其中的一个A物体，将小鼠按原位置重新放入NOR反应箱，自由探索10min，通过视频跟踪系统记录小鼠的行为。观察小鼠探索新放入物体的时间占总时间的百分比，探索率＝(探索新物体的时间/探索总时间)×100％。

新物体识别实验结果如图4所示，由图4可知，采用不同剂量的DNLA灌胃后，小鼠的新物体识别探索率明显高于模型组，并且和阳性药二甲双胍组相当，说明DNLA能够在一定程度上改善AD。

综上所述，通过本发明公开的提取方法提取得到的金钗石斛总生物碱在一定程度上能够缓解AD。

实施例2

本实施例公开了一种金钗石斛总生物碱的提取方法，包括以下步骤：

S1.称取金钗石斛干燥茎依次进行粉碎和过筛，然后称取10kg粉末；

S2.向粉末中加入80wt％的酸性乙醇浸泡药材过夜后，按照1:9的料液比混合，在70℃下回流提取2次，每次提取3h，然后按照1:12的料液比混合，在100℃下回流提取2次，每次提取2h，过滤，合并滤液，浓缩滤液干燥，得到金钗石斛提取物浸膏；

S3.用5wt％盐酸对金钗石斛提取物浸膏进行溶解，过滤，除掉不溶物；

S4.以石油醚萃取后分离得到石油醚层和水层，水层再用饱和氢氧化钠溶液调节pH至10，后采用乙酸乙酯进行萃取8次，合并每次萃取得到的乙酸乙酯层，然后进行浓缩，得到金钗石斛总生物碱浸膏。

实施例3

本实施例公开了一种金钗石斛总生物碱的提取方法，包括以下步骤：

S1.称取金钗石斛干燥茎依次进行粉碎和过筛，然后称取10kg粉末；

S2.向粉末中加入76wt％的酸性乙醇浸泡药材过夜后，按照1:10的料液比混合，在70℃下回流提取2次，每次提取3h，然后按照1:12的料液比混合，在90℃下回流提取2次，每次提取2h，过滤，合并滤液，浓缩滤液干燥，得到金钗石斛提取物浸膏；

S3.用5wt％盐酸对金钗石斛提取物浸膏进行溶解，过滤，除掉不溶物；

S4.以石油醚萃取后分离得到石油醚层和水层，水层再用饱和氢氧化钠溶液调节pH至9.5，后采用乙酸乙酯进行萃取5次，合并每次萃取得到的乙酸乙酯层，然后进行浓缩，得到金钗石斛总生物碱浸膏。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。