一种百合药材中王百合苷A和王百合苷H的提取及测定方法

摘要

本发明提供一种百合药材中王百合苷A和王百合苷H的提取方法，包括：将百合药材样品加入稀甲醇溶解后超声提取，以提供所需提取液。本发明进一步提供了一种百合药材中王百合苷A和王百合苷H的测定方法。本发明还提供一种百合药材中王百合苷A和王百合苷H的测定方法在百合药材的质量检测中的用途。本发明提供的一种百合药材中王百合苷A和王百合苷H的提取及测定方法，线性关系良好，重复性良好、精密度良好、准确度高、稳定性好，可有效提取并准确测定百合药材中王百合苷A和王百合苷H的含量，真实反映百合药材中王百合苷A和王百合苷H的质量差异，全面完善百合药材的质量控制体系。

说明书

技术领域

本发明属于中药成分检测的技术领域，涉及一种百合药材中王百合苷A和王百合苷H的提取及测定方法，具体涉及一种百合药材中王百合苷A和王百合苷H的提取方法以及利用高效液相色谱同时测定百合药材中王百合苷A和王百合苷H含量的方法。

背景技术

百合为百合科植物卷丹Lilium lancifolium Thunb.、百合Lilium browniiF.E.Brown var.viridulum Baker或细叶百合Lilium pumilum DC.的干燥肉质鳞叶。百合鳞叶中主要含有多糖、酚酸甘油酯、甾体皂苷、甾醇、黄酮、苯丙素、生物碱及磷脂、无机盐等成分。酚酸甘油酯是百合大类成分之一，其中包括1-O-阿魏酰甘油、1-O-p-香豆酰甘油、王百合苷A、王百合苷B、王百合苷C、王百合苷D、王百合苷E、王百合苷H等，具有抗氧化、抗肿瘤、抗增殖、免疫调节及雌激素活性等生理功能。其中王百合苷A和王百合苷H为同分异构体，在百合中存在相互转化过程，药理实验结果显示其具有显著的抗抑郁药理活性。

目前2020年版《中国药典》中仅有百合多糖的含量测定，缺少特征性指标成分含量测定。

现有技术文献“不用来源百合药材的质量评级及分析”(刘湘丹,陈勋,刘畅宇,裴刚,周日宝,王智,陈乃宏.不同来源百合药材的质量评价及分析[J].湖南中医药大学学报,2019,39(04):480-484.)公开了一种测定百合药材中王百合苷A含量的方法，其中采用HPLC方法，测定王百合苷A的含量，结果显示54批百合样品中王百合苷A的含量区间为0.019～0.599％。该方法的色谱条件为：色谱柱为Supersil ODS-B(5μm，4.6*250mm)，柱温为30℃，进样量为10μl，流速为1.0ml/min，流动相为0.1％磷酸水溶液∶乙腈＝85∶15(V/V)，检测波长为310nm。该文献未报道王百合苷A不稳定且存在结构转化的问题，也并没有记载如何同时测定相互易转化王百合苷A及其同分异构体王百合苷H的方法。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种百合药材中王百合苷A和王百合苷H的提取及测定方法，可有效提取并准确测定百合药材中王百合苷A和王百合苷H的含量。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种百合药材中王百合苷A和王百合苷H的提取方法，包括：将百合药材样品加入稀甲醇溶解后超声提取，以提供所需提取液。

较佳地，所述百合药材样品为将百合药材粉碎后过筛，获得的百合药材粉末。

优选地，所述过筛的筛网为3号筛网。

较佳地，所述稀甲醇为甲醇水溶液。

优选地，所述甲醇水溶液为体积百分比为30～70％的甲醇水溶液，优选为40～60％。

较佳地，所述百合药材样品加入的质量与稀甲醇加入的体积之比为1：20～80，优选为1：25～75，g/mL。具体例如，1：25～50、1：50～75、1：25、1：50、1：75，g/mL。

较佳地，所述超声提取的时间为40～80分钟，优选为45～75分钟。

较佳地，所述超声提取的功率为200～350W。

较佳地，所述超声提取的频率为40～59KHz。

较佳地，所述超声提取后还要进行放冷、离心、过滤。

优选地，所述放冷冷却至室温。所述室温为20-30℃。

优选地，所述离心的时间为5-15min。

优选地，所述离心的转速为8000-12000r/min。

优选地，所述离心前要进行加入稀甲醇补足减重。以便对样品进行定量。

优选地，所述过滤为取上清液过滤膜，放弃初滤液后，取续滤液。

更优选地，所述滤膜为0.22μm滤膜。

本发明第二方面提供一种百合药材中王百合苷A和王百合苷H的测定方法，包括：将上述提取方法获得的提取液作为供试品溶液，采用高效液相色谱法(HPLC)进行检测，确定供试品溶液中王百合苷A和王百合苷H的含量。

较佳地，所述王百合苷A的CAS号为114420-66-5，所述王百合苷H的CAS号为126239-77-8。

较佳地，采用高效液相色谱法(HPLC)进行检测，包括以下步骤：

1)配制混合对照品溶液：将王百合苷A和王百合苷H的对照品，加入稀甲醇溶解并定容，配成混合对照品溶液；

2)样品检测：采用高效液相色谱法(HPLC)分别检测供试品溶液和步骤1)中的混合对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量，确定供试品溶液中王百合苷A和王百合苷H的含量。

优选地，步骤1)中，所述混合对照品溶液采用先加稀甲醇制备混合对照品储备溶液后，再逐级稀释制得。

更优选地，所述混合对照品储备溶液中，所述王百合苷A的浓度为20μg/mL，所述王百合苷H的浓度为4μg/mL。

优选地，步骤1)中，所述混合对照品溶液中王百合苷A的含量范围为0.08624～0.8624μg/mL，王百合苷H的含量范围为0.01668～0.1668μg/mL。

优选地，步骤1)中，同一所述混合对照品溶液中王百合苷A与王百合苷H的浓度比为5.0～5.5∶1。从而使王百合苷A(WBHGA)与王百合苷H(WBHGH)达到反应平衡，不再发生相互转化。

优选地，步骤1)中，所述稀甲醇为甲醇水溶液。

更优选地，所述甲醇水溶液为体积百分比为30～70％的甲醇水溶液，优选为40～60％。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法(HPLC)中，检测器为紫外-可见分光检测器(UV)或二极管阵列检测器(DAD)。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中的色谱柱为C

更优选地，所述高效液相色谱法中的色谱柱为Waters

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中的检测波长为310～314nm。更优选地，所述检测波长为312nm。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中柱温为30～40℃。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中的流速为0.9～1.1mL/min。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中的进样量为5～20μL。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中，流动相为乙腈-0.09～0.11％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.09～0.11％磷酸水溶液；分析时间为30min；梯度洗脱。

上述0.09～0.11％磷酸水溶液为体积百分数为0.09～0.11％的磷酸水溶液。

更优选地，所述梯度洗脱的具体程序见表1，为：

0～15min，A相：B相体积比为7～13：93～87-7～13：93～87；

15～15.1min，A相：B相体积比为7～13：93～87-20～40：80～60；

15.1～22min，A相：B相体积比为20～40：80～60-20～40：80～60；

22～25min，A相：B相体积比为20～40：80～60-7～13：93～87；

25～30min，A相：B相体积比为7～13：93～87-7～13：93～87。

表1

最优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：

0～15min，A相：B相体积比为10：90-10：90；

15～15.1min，A相：B相体积比为10：90-30：70；

15.1～22min，A相：B相体积比为30：70-30：70；

22～25min，A相：B相体积比为30：70-10：90；

25～30min，A相：B相体积比为10：90-10：90。

优选地，步骤2)中，所述外标法包括以下步骤：

A)按步骤1)制备一系列不同浓度的混合对照品溶液，分别进行HPLC检测，获得王百合苷A和王百合苷H的色谱峰面积与对应王百合苷A和王百合苷H的含量之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，分别计算得到王百合苷A和王百合苷H的标准工作曲线的回归方程；

B)将供试品溶液进行HPLC检测，将获得的王百合苷A和王百合苷H的色谱峰面积，代入步骤A)中相应的王百合苷A和王百合苷H的标准工作曲线的回归方程，计算得到供试品溶液中王百合苷A和王百合苷H的含量。

更优选地，所述标准工作曲线中，以王百合苷A和王百合苷H的色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应王百合苷A和王百合苷H的含量(即浓度)为横坐标(X轴)。

本发明第三方面提供一种百合药材中王百合苷A和王百合苷H的提取方法，和/或一种百合药材中王百合苷A和王百合苷H的测定方法在百合药材的质量检测中的用途。

如上所述，本发明提供的一种百合药材中王百合苷A和王百合苷H的提取及测定方法，采用优化条件的前处理和仪器检测方法，对百合药材中王百合苷A和王百合苷H进行准确的定量定性检测。特别是针对易于互相转化的王百合苷A和王百合苷H，本提取及测定方法，能够使王百合苷A和王百合苷H的分离度达到药典要求，且WBHGA和WBHG对照品溶液稳定不发生转化，在准确检测的同时可以一定程度上避免王百合苷A和王百合苷H相互转化对检测结果的影响，提高了检测的准确度，满足检测要求。

该种方法操作简单，便于控制，制备获得的提取液稳定性好，所测定的2种成分的标准曲线在各自范围内线性关系良好，重复性良好、精密度良好、准确度高、稳定性好，准确性符合药典标准，耐用性良好，可有效提取并准确测定百合药材中王百合苷A和王百合苷H的含量，真实反映百合药材中王百合苷A和王百合苷H的质量差异，全面完善百合药材的质量控制体系，为百合药材的质量控制提供了依据。

附图说明

图1显示为本发明中指定波长条件下，空白溶剂、王百合苷A对照品溶液、王百合苷H对照品溶液、王百合苷A和王百合苷H混合对照品溶液以及百合药材供试品溶液的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

以下实施例使用的试剂和仪器如下：

1、试剂

百合药材(产地：湖南隆回，基原：百合Lilium brownii F.E.Brownvar.viridulum Baker)。王百合苷A对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号10874，纯度≥98.0％)，王百合苷H对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号9560，纯度≥98.0％)。

乙腈(色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司)；磷酸(色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司)；无水甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；超纯水由Milli-Q超纯水处理系统制备。

2、仪器

Waters e2695-2498高效液相色谱仪及Empower色谱工作站(美国Waters公司)；Waters Acquity Arc高效液相色谱仪及Empower色谱工作站(美国Waters公司)；Agilent1260InfinityⅡ高效液相色谱仪及OpenLab CDS工作站(美国Agilent公司)；XSR205 DU/A型电子天平及ME204E/02型电子天平(梅特勒、托利多(上海)有限公司)；SK7200H型超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司)；Milli-Q Direct A10纯水仪(默克化工技术(上海)有限公司)；Waters

实施例1

将百合药材样品粉碎后过三号筛，获得的百合药材粉末精密称定1g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇水溶液50mL，密塞，称定重量。在功率350W、频率53kHz下超声提取60分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，以10000r/min的转速离心10分钟，取上清液过滤膜，放弃初滤液后，取续滤液，即得所需提取液样品1#。

实施例2

将百合药材样品粉碎后过三号筛，获得的百合药材粉末精密称定1g，置具塞锥形瓶中，精密加入40％甲醇水溶液60mL，密塞，称定重量。在功率250W、频率50kHz下超声提取50分钟，放冷，再称定重量，用40％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，以11000r/min的转速离心12分钟，取上清液过滤膜，放弃初滤液后，取续滤液，即得所需提取液样品2#。

实施例3

1、供试品溶液的制备

将实施例1制备获得的提取液样品1#，作为供试品溶液1#。

2、混合对照品溶液的制备

取王百合苷A和王百合苷H的对照品，精密称定，加50％甲醇水溶液配成混合对照品储备溶液。混合对照品储备溶液中，王百合苷A的浓度为20μg/mL，王百合苷H的浓度为4μg/mL。

再将混合对照品储备溶液采用稀甲醇逐级稀释并定容，配成一系列不同浓度的混合对照品溶液。一系列不同浓度的混合对照品溶液中，王百合苷A的含量范围为0.08624～0.8624μg/mL，王百合苷H的含量范围为0.01668～0.1668μg/mL。同一混合对照品溶液中王百合苷A与王百合苷H的浓度比为5.0～5.5∶1。

3、测定

采用高效液相色谱法(HPLC)分别检测供试品溶液1#和一系列不同浓度的混合对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量。即将一系列不同浓度的混合对照品溶液分别进行HPLC检测，获得王百合苷A和王百合苷H的色谱峰面积与对应王百合苷A和王百合苷H的浓度之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，分别计算得到王百合苷A和王百合苷H的标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液1#进行HPLC检测，将获得的王百合苷A和王百合苷H的色谱峰面积，代入相应的王百合苷A和王百合苷H的标准工作曲线的回归方程，计算得到供试品溶液1#中王百合苷A和王百合苷H的浓度。

其中，高效液相色谱法包括以下检测条件：

检测器为紫外-可见分光检测器(UV)；色谱柱为Waters

梯度洗脱的具体程序为：

0～15min，A相：B相体积比为10：90-10：90；

15～15.1min，A相：B相体积比为10：90-30：70；

15.1～22min，A相：B相体积比为30：70-30：70；

22～25min，A相：B相体积比为30：70-10：90；

25～30min，A相：B相体积比为10：90-10：90。

实施例4

取50％甲醇水溶液50mL，按实施例1进行提取，获得空白溶剂样品。

取王百合苷A的对照品，按实施例3的步骤2进行制备，获得王百合苷A对照品溶液。同理，取王百合苷H的对照品，按实施例3的步骤2进行制备，获得王百合苷H对照品溶液。

将空白溶剂样品、王百合苷A对照品溶液、王百合苷H对照品溶液按实施例3的步骤3进行测定，测定结果与供试品溶液1#、混合对照品溶液的结果进行比较，具体数据见图1。由图1可知，本方法能够将王百合苷A和王百合苷H有效分离，并保持王百合苷A和王百合苷H各自的含量稳定，避免王百合苷A和王百合苷H相互转化，提高了检测的准确度。

实施例5

1、供试品溶液的制备

将实施例1制备获得的提取液样品1#，作为供试品溶液2#。

2、混合对照品溶液的制备

取王百合苷A和王百合苷H的对照品，按实施例3中步骤2，制备一系列不同浓度的混合对照品溶液。

3、测定

采用高效液相色谱法(HPLC)分别检测供试品溶液2#和一系列不同浓度的混合对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量。得到供试品溶液2#中王百合苷A和王百合苷H的浓度。具体定量过程同实施例3中步骤3。

其中，高效液相色谱法包括以下检测条件：

检测器为二极管阵列检测器(DAD)；色谱柱为Waters

梯度洗脱的具体程序为：

0～15min，A相：B相体积比为11：89-11：89；

15～15.1min，A相：B相体积比为11：89-35：65；

15.1～22min，A相：B相体积比为35：65-35：65；

22～25min，A相：B相体积比为35：65-11：89；

25～30min，A相：B相体积比为11：89-11：89。

实施例6

对本发明的百合药材样品中王百合苷A和王百合苷H的检测方法进行方法学验证，其性能指标结果如下。

1、线性关系

精密称取王百合苷A和王百合苷H的对照品适量，按实施例3中步骤2加入50％甲醇水溶液配成一系列6个不同浓度的混合对照品溶液。6个混合对照品溶液中，每1ml分别含王百合苷A 86.24、64.68、43.12、21.56、17.248、8.624μg，每1ml分别含王百合苷H16.68、12.51、8.34、4.17、3.336、1.668μg。然后按实施例3中步骤3的色谱条件，分别精密吸取一系列1μL的混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，以王百合苷A和王百合苷H的进样质量(μg)为横坐标(X轴)，并以王百合苷A和王百合苷H相应的峰面积为纵坐标(Y轴)进行回归，绘制标准曲线，计算获得王百合苷A和王百合苷H的标准回归方程、相关系数、线性范围，具体结果见表2。

根据表2可知，王百合苷A和王百合苷H在各自进样质量浓度范围内线性关系良好，说明本发明方法线性范围广，准确度高。

表2

2、稳定性

取批号A2021092801的百合药材样品，按实施例3中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例3中步骤3的色谱条件，分别在0h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h进样分析，记录王百合苷A和王百合苷H的色谱峰面积数据，具体结果见表3。结果表明，王百合苷A和王百合苷H的色谱峰面积在24h内的RSD均小于2％，表明供试品溶液在24h内检测对结果无影响，稳定性良好。

表3

3、仪器精密度

取批号A2021092801的百合药材样品，按实施例3中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例3中步骤3的色谱条件连续进样检测6次，记录色谱峰面积数据，结果见表4。结果表明，王百合苷A和王百合苷H的仪器精密度RSD均小于1％，表明仪器精密度良好。

表4

4、重复性

取批号A2021092801的百合药材样品，精密称定6份，按实施例3中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例3中步骤3的色谱条件进行测定，计算含量，具体结果见表5。结果表明，王百合苷A和王百合苷H的含量RSD均小于1％，表明方法重复性良好。

表5

5、加标回收率

称取9份已知浓度的百合药材粉末样品(已知王百合苷A、王百合苷H含量分别为1.0004mg/g、0.1173mg/g)，每份0.5g，精密称定。分别精密加入王百合苷A对照品和王百合苷H对照品，对照品加入量分别为供试品中含量的50％、100％和150％(每个浓度平行三份)，按实施例3中步骤1制备获得供试品溶液，并按实施例3中步骤3的色谱条件，分别进样分析，记录峰面积，根据测得量和加入量计算各成分的加样回收率和RSD，结果见表6。由表6可知，王百合苷A的加样回收率均在90～108％、王百合苷H的加样回收率均在85～110％，RSD均小于1％，符合2020版《中国药典》(第四部)“9101分析方法验证指导原则”项下的相关要求。

表6

6、中间精密度

上海和黄药业有限公司技术中心不同实验人员分别取同批次百合药材样品(批号A2021092801)，按实施例3中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例3中步骤3的色谱条件进样检测，计算王百合苷A和王百合苷H含量。结果见表7。结果表明，不同实验人员测定王百合苷A和王百合苷H含量的检出量的相对偏差均小于0.5％。同时，两者测定差异为0.07％(即WBHGA+WBHGH总检出量的相对偏差)，中间精密度良好。

表7

7、耐用性

按实施例3中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例3中步骤3的色谱条件进行检测，按照2020版《中国药典》(第四部)“9101分析方法验证指导原则”项下“耐用性”的内容，考察pH、柱温、色谱柱、液相色谱仪器发生轻微变化后王百合苷A、王百合苷H检出值的变化情况，具体结果见表8。结果表明，pH、柱温、色谱柱、液相色谱仪器发生轻微变化后，王百合苷A和王百合苷H检出值变化较小，方法耐用性良好。

表8

实施例7

收集百合药材样品22批，按实施例3中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例3中步骤3的色谱条件进行测定，具体结果见表9。结果表明，22批百合药材中王百合苷A的含量范围为863.38～1583.57μg/g，王百合苷H的含量范围为107.33～256.32μg/g，该方法可用于百合药材中王百合苷A和王百合苷H的质量控制。

表9

综上所述，本发明提供的一种百合药材中王百合苷A和王百合苷H的提取及测定方法，线性关系良好，重复性良好、精密度良好、准确度高、稳定性好，可有效提取并准确测定百合药材中王百合苷A和王百合苷H的含量，真实反映百合药材中王百合苷A和王百合苷H的质量差异，全面完善百合药材的质量控制体系。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。