能够实现对甲基对硫磷快速检测的碳量子点纳米荧光探针

摘要

本发明涉及检测技术领域，公开了一种能够实现对甲基对硫磷快速检测的碳量子点纳米荧光探针，其制备方法为：将经过预处理的玉米秸秆与蒸馏水按料液比为1:10，在250℃温度下反应，待反应釜冷却到室温，将反应后的混合物经真空抽滤，将得到的液体通过0.22μm的滤膜过滤，将得到的滤液移入截留分子质量为1kDa的透析袋中，得到碳量子点纳米荧光探针溶液。本发明采用玉米秸秆CQDs‑NFP，基于IFE成功构建一种用于快速高效检测MP的无酶荧光探针。本发明检测过程通过碱性催化水解法实现，不需要添加任何其他试剂或酶，具有较高灵敏度和稳定性，且成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种能够实现对甲基对硫磷快速检测的碳量子点纳米荧光探针。

背景技术

甲基对硫磷(MP)因具有高毒、高效、广谱的特性，对昆虫具触杀和胃毒作用，常被应用于当今农业生产，并常被加工成乳油或粉剂使用，主要用于防治水稻、果树、蔬菜等作物的多种害虫，降低作物产量损失。随着MP的大量使用，造成土壤、空气、水资源和农作物上存在大量残留。MP经呼吸道、皮肤黏膜、眼睛、胃肠道等多种途径进入生物体，通过抑制神经突触乙酰胆碱酯酶(AChE)而对人和大多数动物有毒，导致乙酰胆碱(ACh)在人体内积累，过度刺激其在突触中的受体并最终损害神经系统，对生物体的健康产生短期或长期的影响。因此，设计和建立快速有效检测自然界MP残留的分析方法具有重要意义。

人们已经开发了许多方法用于检测MP，包括气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱仪(GC/MS)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和表面增强拉曼光谱(SERS)，虽然这些方法可以实现对MP的高灵敏、选择性好和可定量的检测，但大多数方法存在不可避免弊端，例如，仪器成本高、前处理复杂费时、需要熟练的操作等，限制了其在实际应用领域的应用范围。同时也开发了多种检测MP的电化学和光学传感器。大多数涉及酶催化或抑制反应，且一般为乙酰胆碱酯酶(AChE)[13]或有机磷水解酶(OPH)。在不同的条件下酶活性易发生变化，检测条件难以控制，也阻碍其发展。因此，基于碳量子点纳米荧光探针(CQDs-NFP)无酶荧光传感器应运而生。

CQDs-NFP是一种尺寸小于10nm的新型零维碳纳米材料。据报道，CQDs-NFP通常显示出常显示尺寸和激发波长(LEX)依赖性光致发光(PL)行为，具有制造成本低、水溶性好、毒性低、独特的光学性能和良好的生物兼容性等优点。其中制备CQDs-NFP的原料非常广泛，除了常用的试剂外，还有许多生物废弃物，例如抗普茶、西兰花、茉莉叶、马尾藻、羊毛角、污泥。CQDs-NFP可以应用在数个领域，例如生物成像、重金属、农药检测等。其在农药和兽药的检测中用作光信号源，其主要响应机制大致可分为光致电子转移(PET)，共振能量转移(FRET)，内滤效应(IFE)和聚集诱导发射(AIE)。

近年来，基于内滤效应(IFE)的荧光传感器制作简单、灵敏度高受到研究者的青睐。内滤效应是指溶液中若存在着能吸收激发光的物质，就会减少观察到的荧光。当可以吸收激发光物质的浓度过高时，对入射光的吸收作用也增加，相当于降低了激发光的强度。与其他荧光响应机制不同，IFE不涉及任何电子或能量转移过程，这使得分析更容易。此外，分析吸收信号被转换为荧光信号，这提供了灵活性。

发明内容

本发明的目的在于基于CQDs-NFP的内滤效应，构建了一种能够实现对甲基对硫磷快速检测的碳量子点纳米荧光探针。

为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

一种能够实现对甲基对硫磷快速检测的碳量子点纳米荧光探针，制备方法为：将经过预处理的玉米秸秆与蒸馏水按料液比1:10，在250℃温度下反应，待反应釜冷却到室温，将反应后的混合物经真空抽滤，将得到的液体通过0.22μm的滤膜过滤，将得到的滤液移入截留分子质量为1k Da的透析袋中，得到碳量子点纳米荧光探针溶液。

进一步地，玉米秸秆预处理为将玉米秸秆清洗、晾干、粉碎后，过80目筛得到玉米秸秆粉。

优选的，所述玉米秸秆与蒸馏水的反应时间为10小时，滤液在透析袋中透析时间为2天。

进一步地，使用碳量子点纳米荧光探针检测MP的方法为：取CQDs-NFP溶液与PBS缓冲液，形成一个均匀分布的检测液，然后将不同浓度的MP标准液加入检测液，进行孵育后，自然冷却至室温；λ

优选的，检测液pH为12。

优选的，孵育温度为80℃。

优选的，孵育时间为10min。

优选的，CQDs-NFP溶液与PBS缓冲液的体积比为1:18。

优选的，所述PBS缓冲液浓度为0.2M。

优选的，MP浓度在0.005-20μg/ml范围内。

本发明中玉米秸秆与蒸馏水的料液比是指质量与体积之比(g/ml)。

与现有技术相比，本发明采用玉米秸秆CQDs-NFP，基于IFE成功构建一种用于快速高效检测MP的无酶荧光探针。本发明检测过程通过碱性催化水解法实现，不需要添加任何其他试剂或酶，具有较高灵敏度和稳定性，且成本低。

此外，中国是农业大国，玉米种植区域广，副产物玉米秸秆的产量较高，且玉米秸秆含有丰富的碳源，本发明采用玉米秸秆作为制备CQDs-NFP的原材料，还可减少由玉米秸秆带来的环境污染。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为CQDs-NFP的合成工艺和MP的检测原理；

图2(A)MP水解后p-NP的紫外可见吸收光谱和CQDs-NFP的荧光光谱；(B)CQDs-NFP溶液中存在与不存在p-NP时的荧光衰减曲线；

图3(A)不同pH条件下CQDs-NFP和MP的荧光响应；(B)MP在不同水解程度下的吸收光谱；

图4(A)pH对MP检测的影响；(B)温度对MP检测的影响；(C)时间对MP检测的影响；

图5(A)添加不同浓度MP后CQDs-NFP的荧光光谱；(B)添加不同浓度MP的CQDs-NFP的荧光猝灭效率(F0/F)拟合散点图；(C)不同MP浓度与CQDs-NFP的紫外光谱图；

图6(A)50μg/ml MP和500μg/ml其他不同农药诱导的CQDs-NFP荧光光谱；(B)50μg/ml MP和500μg/ml其他不同农药的紫外-可见吸收光谱；(C)50μg/ml MP和500μg/ml其他不同农药诱导的CQDs-NFP荧光猝灭效率(F0/F)；

图7(A)CQDs-NFP传感器的稳定性；(B)CQDs-NFP传感器在检测MP的重现性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

试剂和材料：

玉米秸秆来自于当地(黑龙江省大庆市)农民，对硝基苯酚、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸(制备磷酸盐缓冲溶液)均为分析纯由上海麦克林生化科技有限公司提供。0.22μm针孔滤膜，天津津腾实验设备有限公司；1k Da透析袋，北京博奥拓达科技有限公司；纯净水，杭州哇哈哈集团有限责任公司。甲基对硫磷、倍硫磷、辛硫磷、敌百虫、二嗪农、毒死蜱，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

仪器和设备：

200型高速粉碎机，上海缘沃工贸有限公司；

PHS.2C精密pH计，美国METTLER TOLEDO公司；

AB204-N分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；

RE-2000A旋转蒸发器，郑州市亚荣仪器有限公司；

Alpha1-2Ldplus冷冻干燥机，德国CHRIST公司；

KH-200水热反应釜，巩义市科瑞仪器有限公司；

NICOLETiS10型傅里叶变换红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技；

TU-1810紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；

RF6000荧光分光光度计，日本(京都)岛津制作所；

TEM-2100F透射电子显微镜，日本电子株式会社；

碳量子点纳米荧光探针的制备：

将玉米秸秆清洗、晾干、粉碎后，过80目筛得到玉米秸秆粉。将秸秆粉与蒸馏水按料液比为1:10量取(g/ml)，将混合物转移到200mL聚四氟乙烯反应釜中，在250℃温度下反应10h，待反应釜冷却到室温，将反应后的混合物经真空抽滤，得到淡黄色液体。将得到的液体通过0.22μm的滤膜过滤，将得到的滤液移入截留分子质量为1kDa的透析袋中，透析2d，去除小分子，得到碳量子点纳米荧光探针溶液，将溶液倒入容器后放入冰箱，备用。

采用制备的碳量子点纳米荧光探针对甲基对硫磷进行检测：首先取200μL CQDs-NFP溶液与3.6mL PBS缓冲液(0.2M)在5mL离心管中形成一个均匀分布的检测液，然后将200μL不同浓度的MP标准液加入检测液(MP的浓度在0.005-20μg/ml范围内)，混合物在80℃下孵育10min，自然冷却至室温。λ

本发明传感机理是基于CQDs-NFP的荧光猝灭，如图1所示。MP的水解产物p-NP可以通过IFE、PET、FRET猝灭CQDs-NFP的荧光。其中IFE是由于荧光材料的激发和发射光谱与吸收体的吸收光谱之间的光谱重叠而产生。本发明采用p-NP作为吸收剂，基于IFE，在403nm波长处间接测定MP。原理是通过碱性催化水解MP生成p-NP，溶液颜色变为黄色。

基于CQDs-NFP传感器用于MP分析的传感机理，由图2A所示，在360nm的激发波长，CQDs-NFP在440nm表现出强烈的蓝色荧光，同时，对p-NP的紫外-可见光谱的(Abs)最大吸收峰在403nm处，与CQDs-NFP的激发波长(EX)和发射波长(EM)发生了很大程度的重叠，表明CQDs-NFP和p-NP之间存在FRET或IFE。

为了确认p-NP与CQDs-NFP之间的相互作用为IFE，测试CQDs-NFP溶液中存在(CQDs-NFP+p-NP)与不存在p-NP(CQDs-NFP)时的荧光寿命，由图2B所示，在CQDs-NFP溶液中加入p-NP后其荧光衰减曲线的路径并没有改变，说明p-NP与CQDs-NFP间没有发生能量转移，证明p-NP与CQDs-NFP间的相互作用为IFE。

为了确定MP在pH＝12时分解为p-NP，分别测定MP在酸性和碱性条件下荧光强度。如图3A所示，酸性条件下，在反应溶液中加入MP时，CQDs-NFP的荧光几乎不会发生变化(标识为CQDs-NFP+MP(pH<7))；而在碱性溶液(pH＝12)中加入MP时，溶液的荧光强度急剧下降(标识为CQDs-NFP+MP(pH＝12))，同时溶液颜色由无色变为黄色。这说明MP在强碱性环境下会快速水解产生p-NP，p-NP通过IFE使CQDs-NFP的荧光发生猝灭，与MP在碱性条件下分解产生p-NP含量有关。为了确定MP是否能完全水解为p-NP，测定了MP不同水解程度的紫外吸收光谱图(未分解、部分分解、全部分解MP分别标识为：MP、Partial hydrolysis、Completehydrolysis)，如图3B所示，MP未水解时吸收峰在300nm处，水解后会在403nm处产生p-NP的吸收峰，随着水解程度的增强，300nm处的吸收峰逐渐减弱，403nm处的吸收峰逐渐增强，直至300nm处的吸收峰会完全消失，说明MP已经完全水解为p-NP。

检测条件的优化：

(1)pH优化

取200μL CQDs-NFP溶液与3.6mL PBS缓冲液(pH分别为5、6、7、8、9、10、11、12)在5mL离心管中形成一个均匀分布的检测液，然后将200μL浓度为15μg/ml MP标准液加入检测液，混合物在90℃下孵育30min，自然冷却至室温。λ

pH值作为推动水解反应最关键的影响因素。不仅影响p-NP的荧光强度，而且也影响MP水解为p-NP的反应速率。通过研究pH值为5.0-13.0条件下，依据p-NP荧光猝灭效率F0/F确定最佳反应pH。如图4A所示，pH<7时，MP未发生水解，因此p-NP的荧光不会发生猝灭；而随着pH在7-12之间，MP的水解程度越来越大，猝灭效率也随之逐渐增强，在pH＝12时猝灭效率达到最大值；随着pH值进一步增加时，猝灭效率不再继续增强，因此pH＝12为MP快速转化为p-NP最佳酸碱环境。

(2)反应温度优化

取200μL CQDs-NFP溶液与3.6mL PBS缓冲液(pH＝12)在5mL离心管中形成一个均匀分布的检测液，然后将200μL浓度为15μg/ml MP标准液加入检测液，混合物分别在30、40、50、60、70、80、90℃下孵育30min，自然冷却至室温。λ

反应温度影响MP水解为p-NP速率，反应温度条件设置为30-90℃，孵育一定时间，如图4B所示，CQDs-NFP荧光猝灭效率F0/F在30-80℃成正相关，传感器的荧光响应与之呈正相关增加。这表明，动能上升引起碰撞频率的增加直接加快了MP在较高温度下的水解速率，之后趋于平稳。因此80℃为最佳反应温度。

(3)反应时间优化

取200μL CQDs-NFP溶液与3.6mL PBS缓冲液(pH＝12)在5mL离心管中形成一个均匀分布的检测液，然后将200μL浓度为15μg/ml MP标准液加入检测液，混合物在80℃下分别孵育5、10、15、20、25、30、35min，自然冷却至室温。λ

反应时间影响MP水解为p-NP的速率，反应时间设置5、10、15、20、25、30、35min。如图4C所示，CQDs-NFP荧光猝灭效率F0/F呈现先上升后趋于稳定。确定10min最佳反应温度，说明此时已达到水解反应的平衡。

检测线和检测范围

在最优实验条件下，研究了CQDs-NFP对MP的响应性能。如图5A所示，随着MP浓度的增加，CQDs-NFP的荧光响应F0/F(F0、F分别为不存在和存在MP时荧光强度)逐渐增大，F0/F与MP的浓度在0.005-20μg/ml范围呈现线性关系(F0/F＝0.0993*C+1.0297，R

此外，随着MP含量的增加，CQDs-NFP的荧光不仅逐渐猝灭，而且CQDs-NFP的λ

与表1中报道的其他荧光方法相比，基于IFE的传感器表现出相对较高的灵敏度。本发明检测过程通过碱性催化水解法实现，不需要添加任何其他试剂或酶。因此，本发明方法具有成本低、稳定性好等优点。

表1基于IFE荧光传感器与其他检测MP荧光传感器的比较

选择性评估：

为了评估本发明方法的选择性，一系列与MP化学结构相似的农药，例如，倍硫磷(Fenthion)、敌百虫(Trichlorfon)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、二嗪农(Diazinon)、辛硫磷(Phoxim)。分别按照最佳检测条件，以上每种农药的添加量为500μg/ml，MP的添加量为40μg/ml。并在80℃下孵育10min以确保完全反应，均测定荧光强度(F0和F)和吸光度。

结果如图6A所示，只有MP对CQDs-NFP有明显的荧光猝灭作用，其他农药对CQDs-NFP荧光强度的影响可忽略不计。因此，CQDs-NFP荧光传感器对MP的响应具有较高的选择性。而由图可6B知，CQDs-NFP荧光传感器具有高选择性的原因是，只有加入目标检测MP时，才会水解产生在403nm处有强吸光度的p-NP，而加入10倍浓度的其他干扰农药不能水解产生在403nm处有吸光度的物质，故干扰农药不能猝灭CQDs-NFP的荧光。

检测方法稳定性与精密度：

通过长期监测CQDs-NFP的荧光强度来评估稳定性。将CQDs-NFP存放在4℃冰箱中，每3天测定一次荧光强度，测量周期定为30天，记录荧光强度变化程度，评价本发明检测方法稳定性。

评估本发明CQDs-NFP传感器的精密度，在最优检测条件下，研究了检测过程中不同批次与同一批次不同平行样间传感器荧光响应的差异，以评估所构建的传感器在MP检测中的精密度。

结果如图7A可知，CQDs-NFP在存放超过1月后荧光强度保持初始强度记录荧光强度的91.18％，说明CQDs-NFP作为该荧光传感器的信号输出材料具有良好的稳定性。

为了验证CQDs-NFP传感器的精密度，在最优检测条件下，研究了检测过程中不同批次与同一批次不同平行样间传感器荧光响应的差异。如图7B所示，CQDs-NFP传感器对MP的检测在十个不同批次与同一批次五个平行样中的最大相对标准偏差(RSD)分别为4.53％和3％，表明本发明所制备的CQDs-NFP荧光传感器精密度高。

实用性和实际应用

为了探讨该传感器的实用性，将大米样品磨粉过80目筛，将5g大米样品称入50ml离心管中，分别将1、2、4、12、20μg的MP加入大米样品中，置于4℃冰箱中静置一晚使其与样品充分混合。样品提取采用改进QuEchERS法，先与5ml超纯水混合，涡旋1min，再与10ml乙腈混合，涡旋1min；加入5g NaCl，涡旋1min，使其充分混匀后进行脱水和盐析，并以5000rpm离心10min。取全部上清液置于含有450mg C

如表2所示的检测结果表明，根据线性方程F0/F＝0.0993*C+1.0297计算得到加标样品的试剂检出量，实际检出量与添加量的比值即为加标回收率，由此得到加标回收率92.2％-104.3％之间，最大相对标准偏差(RSD)为3.87％，这表明所建立的检测方法用于实际样品分析具有较高准确度。

表2CQDs-NFP传感器测定大米样品MP加标测定

本发明方法采用玉米秸秆CQDs-NFP，基于IFE成功构建一种用于快速高效检测MP的无酶荧光传感器。本发明方法具有较高灵敏度和稳定性。传感加标回收率为92.2％-104.3％，相对标准偏差(RSD)小于3.87％。本发明传感器用于复杂粮食样品的检测是有效可行的。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。