一种靶向损伤节段背根神经节的pH响应镇痛药及其应用

摘要

本发明公开了一种靶向损伤节段背根神经节的pH响应镇痛药及其应用，属于生物医药技术领域。本发明基于在外周神经损伤引起的神经病理性疼痛条件下，受损伤节段背根神经节持续存在局部酸环境，提出以损伤节段背根神经节作为药物作用靶点来制备外周神经损伤镇痛药物，采用pH响应载体包埋镇痛药物，使其在受损伤节段的背根神经节部位释放并发挥作用，其镇痛效果达到同种药物全身作用的镇痛水平。本发明实现了在酸性病灶处精准用药，显著减少药物在其他部位的释放，大大降低现有阿片类用药存在的成瘾性等毒副作用。另外，药物在损伤节段背根神经节持续缓释，显著延长镇痛作用时间，避免镇痛药的过度使用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种靶向损伤节段背根神经 节的镇痛药及其在制备治疗外周神经损伤引起的神经病理性疼痛的药物 中的应用。

背景技术

阿片类药物即麻醉性镇痛药，是治疗中、重度急、慢性疼痛的最常用 药物。通过与外周及中枢神经系统(脊髓及脑)的阿片受体结合发挥镇痛作 用。目前已证实的阿片类受体包括μ、κ、δ和孤啡肽四型，其中μ、κ和 δ受体都与镇痛相关。

阿片类药物种类多样，临床上根据镇痛强度不同分为强阿片药和弱阿 片药。在癌痛治疗时，根据世界卫生组织(WHO)三阶梯治疗原则，弱阿片 药为二阶梯用药，强阿片药为三阶梯用药。弱阿片药有可待因(codeine)、 双氢可待因(dihydrocodeine)等，主要用于轻、中度急性疼痛镇痛；强阿片 药包括吗啡(morphine)、芬太尼(fentanyl)、哌替啶(meperidine)、舒芬太尼 (sulfentanyl)、羟考酮(oxycodone)和氢吗啡酮(hydromorphone)等，主要用于 术后中、重度疼痛治疗。

强效纯激动剂型阿片类药物镇痛作用强，无器官毒性，无封顶效应， 使用时遵循能达到最大镇痛和不产生难以忍受不良反应的原则。但是阿片 类药物的镇痛作用和不良反应均为剂量依赖和受体依赖，其副作用主要表 现为：呼吸抑制、成瘾、耐药性、生理依赖、难戒断、肌僵直、肌阵挛、 惊厥、便秘等。临床上阿片类药物是慢性疼痛治疗中不可或缺的一部分， 其为一种强效镇痛药物，镇痛效果好，但是由于长时间使用其副作用多且 严重，限制了其在慢性疼痛中的长期应用。

如何能做到既持续缓解疼痛又不引起损害(如滥用、过量使用和成瘾 等)地使用阿片类药物，这是一个富有挑战性的难题。

目前，在神经病理性疼痛的靶向治疗中，已有报道将吗啡或羟吗啡酮 用脂质体包裹皮下注射，可以显著延长其镇痛时间，但是由于其缺乏靶向 特异性，无法精准作用于病灶部位(Smith LJ,et al.A single dose of liposome-encapsulated hydromorphoneprovides extended analgesia in a rat model of neuropathic pain.Comp Med.2006Dec；56(6):487-92.),(Smith LJ,et al.A single dose of liposome-encapsulatedoxymorphone or morphine provides long-term analgesia in an animal model ofneuropathic pain.Comp Med.2003 Jun；53(3):280-7.)。也有报道利用内涵体中酸环境的特点，设计了包含有神 经激肽的酸响应聚合物，可以同时作用于中枢和外周的内涵体，从而缓解 疼痛，但是它作用部位太广泛，不可避免地引起一系列的副作用，同时其 复杂的聚合物结构也增加了其临床转化的难度(Ramírez-García PD,et al.A pH-responsivenanoparticle targets the neurokinin 1 receptor in endosomes to preventchronic pain.Nat Nanotechnol.2019 Dec；14(12):1150-1159.)。

因此，开发一种具有靶向性的镇痛药物减少副作用产生是本领域技术 人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明旨在克服上述缺陷，提供一种既能有效镇痛同时又能解决阿片 类药物存在的一系列副作用问题的镇痛药物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提出以损伤节段背根神经节作为靶点在制备外周神经损伤镇 痛药中的应用，所述镇痛药为靶向损伤节段背根神经节的pH响应镇痛药 物。

本发明前期研究发现，在外周神经损伤引起的神经病理性疼痛条件 下，只有受损伤节段的背根神经节(DRG)持续存在局部酸环境，其他节段 的背根神经节不存在该现象。通过激活受损伤节段背根神经节部位的μ阿 片受体，可以有效镇痛。

基于该发现，本发明提出制备一种靶向损伤节段背根神经节的pH响 应镇痛药物，以损伤节段背根神经节作为药物作用靶点实现外周神经损伤 引起疼痛的治疗。

所述pH响应镇痛药物是指仅在酸环境(pH＜7)条件下，释放出镇痛活 性成分从而发挥镇痛作用。

所述的外周神经损伤是指中枢神经(脑和脊髓)以外的神经受损，它包 括12对脑神经和31对脊神经和植物性神经。

进一步的，所述pH响应镇痛药物为通过pH响应载体包埋镇痛活性 成分形成的复合物，即所述pH响应镇痛药由pH响应载体和由载体包埋 的镇痛药物组成。

作为优选，pH响应载体为pH响应脂质体。本发明通过pH响应脂质 体包埋镇痛药，改变药物剂型，可以大大减少药物通过血脑屏障进入中枢 神经系统，降低镇痛药的毒副作用。同时，该药物可以靶向受损伤节段的 背根神经节(DRG)，利用该酸性病灶处的酸环境释放出镇痛药活性成分从 而发挥其镇痛作用。

所述pH响应脂质体可以由pH响应脂质分子组成，也可以由其他pH 响应聚合物组成。

具体的，所述pH响应脂质的亲水部分含有pH响应基团，这些基团 包含可去质子化的羧基或可质子化的胺基。

作为优选，所述pH响应脂质体的组成包括磷脂酰乙醇胺和油酸。通 过调节两种脂质的比例，可以改变其pH响应性，使其在损伤背根神经节 的酸性pH下有效释放。

进一步的，所述pH响应镇痛药的活性成分为阿片类药物。研究表明， 背根神经节中具有阿片受体，所述阿片类药物与阿片受体结合发挥镇痛作 用。具体的，所述阿片类药物为μ阿片受体激活剂，包括但不限于吗啡、 芬太尼、瑞芬太尼、阿芬太尼、氢吗啡酮、舒芬太尼、盐酸纳布啡、布托 啡诺和羟考酮。

进一步的，本发明提供了一种靶向损伤节段背根神经节的镇痛药物， 所述镇痛药物包括pH响应载体和由载体包埋的阿片类药物。利用pH响 应载体对阿片类药物进行包埋制成pH响应镇痛药物。

作为优选，所述pH响应载体为pH响应脂质体,其组成包括磷脂酰乙 醇胺和油酸。

本发明提供了一种制备上述包封有阿片类药物的pH响应镇痛药物的 方法，包括以下步骤：

(1)将磷脂酰乙醇胺和油酸溶于有机溶剂中，减压除去有机溶剂形成脂 质薄膜；

(2)加入含有阿片类药物的缓冲溶液进行水合反应，完全水化后通过滤 膜挤压成型，制得所述pH响应镇痛药物。

作为优选，所述有机溶剂为三氯甲烷、乙醚、四氢呋喃或氯仿等低沸 点溶剂。结合超声处理使得原料完全溶解。

作为优选，步骤(1)中，磷脂酰乙醇胺与油酸的摩尔比为1.5～4：1。更 为优选，磷脂酰乙醇胺与油酸的摩尔比为7：3。

作为优选，待磷脂酰乙醇胺和油酸完全溶于有机溶剂后，于35～55℃ 条件下从400MPa缓慢减压至20MPa(液面无明显气泡产生)，以30～120 转/分的转速蒸干混合溶液，再利用真空干燥完全除去有机溶剂。

步骤(2)中，阿片类药物按照与成膜材料的质量比添加，控制在10％ 以内。

作为优选，将阿片类药物溶于磷酸盐缓冲液制备阿片类药物缓冲溶 液。

作为优选，水合反应的条件为：35～55℃条件下水化10～20小时。更 为优选，在35～40℃条件下水化12小时。

药物的粒径可以通过不同的滤膜孔径控制，考虑到生物体内应用以及 减少在大脑等中枢神经的积蓄，产物的粒径范围控制在50～400nm。作为 优选，步骤(2)中，将水化产物通过孔径为220nm的水相滤膜进行挤压成 形。

上述制备方法采用的成膜材料简单易得，价格优势巨大，且制备工艺 简便，在上述条件下制备的pH响应镇痛药物包封率较高、性能稳定。研 究表明，本发明制备的pH响应镇痛药物既能够在受损伤节段的背根神经 节(DRG)持续释放出阿片类药物，延长作用时间，同时能显著减少药物进 入大脑的量，降低成瘾性、减少副作用。

进一步的，本发明提供了所述的靶向损伤节段背根神经节的镇痛药物 在制备治疗外周神经损伤引起疼痛的药物中的应用。

所述pH响应镇痛药物在受损伤节段背根神经节的局部酸性环境下释 放出阿片类药物活性物质进而发挥其镇痛作用。

实际应用时，可以将所述药物制成注射液、冻干粉剂或喷雾剂进行应 用。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明基于在外周神经损伤引起的神经病理性疼痛条件下，受损伤 节段背根神经节持续存在局部酸环境，首次提出以损伤节段背根神经节作 为药物作用靶点来制备外周神经损伤镇痛药物，采用pH响应载体包埋镇 痛药物，使其在受损伤节段的背根神经节部位释放并发挥作用，其镇痛效 果达到同种药物全身作用的镇痛水平。

(2)由于本发明实现了在酸性病灶处精准用药，显著减少药物在其他部 位的释放，大大降低现有阿片类用药存在的成瘾性等毒副作用。

(3)本发明通过对药物改造，使得药物在损伤节段背根神经节持续缓 释，显著延长镇痛作用时间，避免镇痛药的过度使用。

附图说明

图1为实施例1-9制备的pH响应镇痛药物的动态光散射数据。

图2为实施例1制备的吗啡pH响应镇痛药物的电镜图片，其中(A) 图的标尺为100nm，(B)图的标尺为20nm。

图3为实施例1制备的吗啡pH响应镇痛药物的电位图。

图4为实施例1制备的吗啡pH响应镇痛药物在不同pH条件下吗啡 的释放曲线。

图5为神经病理性疼痛模型背根神经节酸性病灶检测结果，其中(A) 图为小鼠尾静脉注射酸响应或非酸响应小分子探针，6小时后荧光信号的 全身分布情况，(B)图为将上述活体成像小鼠的同侧腰3和腰4神经节、 对侧腰3和腰4神经节和腰3-4节段脊髓取出，观察各组织的荧光信号强 度，#1为1号神经病理性疼痛模型小鼠，#2为2号神经病理性疼痛模型 小鼠，#3为3号神经病理性疼痛模型小鼠。

图6为神经病理性疼痛模型后0天、3天、7天和14天小鼠尾静脉注 射pH响应脂质体，24小时后其在大脑、脊髓以及各个神经节中的分布情 况。

图7为取实施例1所制得的吗啡pH响应镇痛药物，按照吗啡量5mg kg

图8为取实施例1所制得的吗啡pH响应镇痛药物，按照吗啡量5mg kg

图9为取实施例1所制得的吗啡pH响应镇痛药物，按照吗啡量10mg kg

图10为取实施例1所制得的吗啡pH响应镇痛药物，按照10mg kg

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明 本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情 况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范 围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使 用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

磷脂酰乙醇胺，CAS:39382-08-6；油酸，CAS:112-80-1；吗啡，东北 制药集团第一制药有限公司；舒芬太尼、瑞芬太尼、芬太尼、氢吗啡酮、 阿芬太尼，宜昌人福药业有限公司；布托菲诺注射液，江苏恒瑞医药股份 有限公司；盐酸羟考酮注射液(奥诺美)，RAFALABORATORIES LIMITED。

实施例1：吗啡pH响应镇痛药物的制备

精确称取0.1g的磷脂酰乙醇胺和0.016g油酸(摩尔比7/3)，放入25 mL的茄形瓶中，加入6mL的三氯甲烷，超声10S完全溶解后，于35℃ 水浴锅中缓慢减压(400-20MPa)至液面无明显气泡产生，以90转每分的转 速蒸干混合溶液至形成一层均匀的脂质薄膜；真空干燥24小时完全除去 有机溶剂，然后加入15mL浓度为0.133mg mL

实施例2：瑞芬太尼pH响应镇痛药物的制备

精确称取0.1mg的磷脂酰乙醇胺和0.016mg油酸(摩尔比7/3)，放入 5mL的茄形瓶中，加入2mL的三氯甲烷，超声5S完全溶解后，于40℃ 水浴锅中缓慢减压(400-20MPa)，以80转每分的转速蒸干混合溶液至形成 一层均匀的脂质薄膜；真空干燥24小时完全除去有机溶剂，然后加入3mL 浓度为100μg mL

实施例3：阿芬太尼pH响应镇痛药物的制备

精确称取0.86mg的磷脂酰乙醇胺和0.21mg油酸(摩尔比6/4)，放入 5mL的茄形瓶中，加入2mL的三氯甲烷，超声25S完全溶解后，于40℃ 水浴锅中缓慢减压(400-20MPa)，以80转每分的转速蒸干混合溶液至形成 一层均匀的脂质薄膜；真空干燥24小时完全除去有机溶剂，然后加入3mL 浓度为1.5mg mL

实施例4：氢吗啡酮pH响应镇痛药物的制备

精确称取0.1mg的磷脂酰乙醇胺和0.016mg油酸(摩尔比7/3)，放入 25mL的茄形瓶中，加入10mL的乙醚，超声50S完全溶解后，于35℃ 水浴锅中缓慢减压(400-20MPa)，以90转每分的转速蒸干混合溶液至形成 一层均匀的脂质薄膜；真空干燥24小时完全除去有机溶剂，然后加入15 mL浓度为2mg mL

实施例5：舒芬太尼pH响应镇痛药物的制备

精确称取0.1mg的磷脂酰乙醇胺和0.016mg油酸(摩尔比7/3)，放入 25mL的茄形瓶中，加入10mL的三氯甲烷，超声10S完全溶解后，于 35℃水浴锅中缓慢减压(400-20MPa)，以90转每分的转速蒸干混合溶液至 形成一层均匀的脂质薄膜；真空干燥24小时完全除去有机溶剂，然后加 入15mL浓度为50μg mL

实施例6：芬太尼pH响应镇痛药物的制备

精确称取0.1g的磷脂酰乙醇胺和0.016g油酸(摩尔比7/3)，放入25 mL的茄形瓶中，加入6mL的三氯甲烷，超声10S完全溶解后，于35℃ 水浴锅中缓慢减压(400-20MPa)，以70转每分的转速蒸干混合溶液至形成 一层均匀的脂质薄膜；真空干燥24小时完全除去有机溶剂，然后加入5mL 浓度为50μg mL

实施例7：盐酸布诺啡pH响应镇痛药物的制备

精确称取0.1g的磷脂酰乙醇胺和0.016g油酸(摩尔比7/3)，放入25 mL的茄形瓶中，加入6mL的三氯甲烷，超声10S完全溶解后，于35℃ 水浴锅中缓慢减压(400-20MPa)，以90转每分的转速蒸干混合溶液至形成 一层均匀的脂质薄膜；真空干燥24小时完全除去有机溶剂，然后加入5mL 浓度为10mg mL

实施例8：布托菲诺pH响应镇痛药物的制备

精确称取0.01g的磷脂酰乙醇胺和0.0016g油酸(摩尔比7/3)，放入 10mL的茄形瓶中，加入3mL的三氯甲烷，超声10S完全溶解后，于35℃ 水浴锅中缓慢减压(400-20MPa)，以90转每分的转速蒸干混合溶液至形成 一层均匀的脂质薄膜；真空干燥24小时完全除去有机溶剂，然后加入3mL 浓度为1mg mL

实施例9：羟考酮pH响应镇痛药物的制备

精确称取0.1g的磷脂酰乙醇胺和0.016g油酸(摩尔比7/3)，放入25 mL的茄形瓶中，加入6mL的三氯甲烷，超声10S完全溶解后，于35℃ 水浴锅中缓慢减压(400-20MPa)，以80转每分的转速蒸干混合溶液至形成 一层均匀的脂质薄膜；真空干燥24小时完全除去有机溶剂，然后加入5mL 浓度为5mg mL

性能测试例

一、利用动态光散射对实施例1-9制备的pH响应镇痛药物进行粒径 测定，结果如图1所示。

实施例1制备的吗啡pH响应镇痛药物平均尺寸为260.5nm，PDI为 0.026，具有较好的均一性。

实施例2制备的瑞芬太尼pH响应镇痛药物尺寸为259.8nm，PDI为 0.061。

实施例3制备的阿芬太尼pH响应镇痛药物尺寸为281.0nm，PDI为 0.327。

实施例4制备的氢吗啡酮pH响应镇痛药物尺寸为300.8nm，PDI为 0.041。

实施例5制备的舒芬太尼pH响应镇痛药物尺寸为302.1nm，PDI为 0.151。

实施例6制备的芬太尼pH响应镇痛药物尺寸为259.1nm，PDI为 0.148。

实施例7制备的盐酸布诺啡pH响应镇痛药物尺寸为219.1nm，PDI 为0.163。

实施例8制备的布托菲诺pH响应镇痛药物尺寸为233.6nm，PDI为 0.169。

实施例9制备的羟考酮pH响应镇痛药物尺寸为221.3nm，PDI为 0.200。

二、图2为实施例1制备的吗啡pH响应镇痛药物的TEM电镜图， 可以观察到较为规则的球形颗粒，分散性良好，且尺寸均一。

三、图3为实施例1制备的吗啡pH响应镇痛药物的电位图，测得其 Zeta电位为-43.6mV～-49.9mV。且在一周内几乎没有太大变化，说明其 具有很高的稳定性。

四、利用动态膜透析法，测定实施例1制备的吗啡pH响应镇痛药物 在不同pH的PBS缓冲溶液中的释放情况，结果如图4所示，该pH响应 镇痛药物的包封率为60％，该脂质体药物在不同pH下释放速率有显著区 别，在酸性条件下的释放速率明显更快。

应用例

一、构建外周神经损伤引起的神经病理性疼痛模型

小鼠腰4脊神经结扎模型：首先使小鼠处于麻醉状态，剪开小鼠下背 部皮肤，直到暴露出腰椎横突，横突取出后，用6-0无菌丝线将腰4脊神 经下段结扎，并在结扎远端将脊神经剪断。术后将肌肉和皮肤逐层缝合。

二、背根神经节酸性病灶检测

模型组小鼠尾静脉注射酸响应或非酸响应小分子探针，假手术组小鼠 同前，6小时后通过小动物活体成像仪观察荧光信号的全身分布。

结果如图5所示，只有模型组小鼠尾静脉注射酸响应小分子探针时才 会在受损伤侧背根神经节部位出现强信号(图5A)；将上述活体成像小鼠的 同侧腰3和腰4神经节、对侧腰3和腰4神经节和腰3-4节段脊髓取出， 观察各组织的荧光信号强度，结果发现同侧腰4神经节的信号强度显著高 于对侧腰4神经节和同侧腰3神经节(图5B)。以上结果说明受损伤侧节段 的背根神经节具有局部酸环境特点。

三、pH响应脂质体的靶向部位检测

参照实施例1吗啡脂质体制备方法，在制膜过程中加入荧光分子，成 膜后加入适量PBS水化，制成荧光标记脂质体。造模后0天、3天、7天 和14天的模型组小鼠分别尾静脉注射pH响应脂质体，24小时后测定其 在大脑、脊髓以及各个神经节中的分布。

如图6所示，荧光标记脂质体主要出现在受损伤节段的背根神经节 (DRG)部位，表明pH响应脂质体可以有效减少进入大脑的量，同时在DRG 部位释放。

四、pH响应镇痛药物的代谢释放情况

取实施例1所制得的吗啡pH响应镇痛药物。按照吗啡量5mg kg

结果如图7所示，吗啡pH响应镇痛药物会在受损伤DRG处释放， 相比于吗啡单药，浓度差可以达到4倍。表明pH响应脂质体包埋的吗啡 药物在带来较好治疗效果的同时，有效减少在其他部位的释放，降低毒副 作用。

五、pH响应镇痛药物的镇痛效果

取实施例1所制得的吗啡pH响应镇痛药物。按照吗啡量5mg kg

同时设置对照组，包括神经病理性疼痛小鼠尾静脉或皮下注射药物溶 剂(PBS)、吗啡单药(5mg kg

机械缩足频率检测：用0.4g von Frey纤维丝通过金属网眼垂直刺激 小鼠后足底中心皮肤，至纤维丝弯曲成S形，刺激持续约1s，重复10次， 间隔10-15s，观察小鼠的反应。如果小鼠在刺扎时间内或移开von Frey 纤维丝时出现快速的缩足或舔足反应，记为阳性；若无反应，则视为阴性。 在10次刺激中，缩足反应以缩足频率的百分比来表示:(缩足次数/10次试 验)/100＝反应频率％。

结果如图8和图9所示，与溶剂组相比，吗啡单药在静脉给药后2小 时内缩足频率显著降低，说明吗啡单药在2小时内有明显镇痛效果；非响 应吗啡脂质体有略微镇痛效果，但是没有统计学差异；pH响应吗啡脂质 体在给药后6小时内有显著的镇痛效果。提示pH响应吗啡脂质体药物可 以明显延长镇痛作用时间。

六、副作用

取实施例1所制得的吗啡pH响应镇痛药物皮下注射后，观察其副作 用，包括戒断症状、对心率的影响、对血氧的影响、对运动协调性的影响、 对运动距离的影响以及对排便的影响。

吗啡戒断实验：神经病理性疼痛小鼠在造模后连续6天，每天2次， 皮下注射20mgkg

心率和血氧监测：正常小鼠皮下注射10mg kg

转棒实验：将正常小鼠放置在4rpm转速的转棒仪上5分钟，训练2-3 次；训练结束后，在4-45rpm逐渐加速5分钟的转棒仪上，记录正常小鼠 皮下注射10mg kg

旷场实验：将正常小鼠放置在旷场中适应5分钟，然后皮下注射溶剂 (PBS)、10mgkg

排便：正常小鼠皮下注射溶剂(PBS)、10mg kg

如图10所示，(A)显示与吗啡单药相比，皮下注射pH响应吗啡脂质 体后小鼠跳跃次数显著减少，提示戒断症状明显减轻；(B)显示与给药前 相比，吗啡单药在皮下注射后5-30分钟心率显著减慢，而皮下注射pH响 应吗啡脂质体对心率没有明显影响；(C)显示与吗啡单药相比，皮下注射 pH响应吗啡脂质体对血氧饱和度的影响明显减弱；(D)显示与吗啡单药相 比，皮下注射pH响应吗啡脂质体可以显著延长小鼠在转棒仪上的平衡时 间，提示pH响应吗啡脂质体对运动协调性没有明显影响；(E)显示与溶剂 组相比，皮下注射吗啡单药会显著增加小鼠的运动距离，但是pH响应吗 啡脂质体对运动距离则没有明显影响，提示pH响应吗啡脂质体不会增加 小鼠的运动距离；(F)为皮下注射溶剂、吗啡单药和pH响应吗啡脂质体后 运动轨迹的典型图，提示皮下注射溶剂或pH响应吗啡脂质体后的运动距 离相当，而皮下注射吗啡单药后运动距离显著增加；(G)显示与溶剂组相 比，皮下注射吗啡单药会显著减少小鼠的粪便颗粒数，而pH响应吗啡脂 质体对小鼠产生的粪便颗粒数没有显著影响，提示pH响应吗啡脂质体不 会对小鼠的排便产生明显影响。

综上，pH响应吗啡脂质体药物可以显著减少吗啡对神经系统、循环 系统、呼吸系统、消化系统副作用。