一种耳念珠菌及其在构建氟康唑单药耐药模型中的应用

摘要

本发明涉及一种耳念珠菌及其在构建氟康唑单药耐药模型中的应用。所述耳念珠菌(Candida auris)CAMS‑CCPM‑D 51242已经于2021年11月12号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.23790。本发明排除了耳念珠菌多重耐药的风险，可以研究氟康唑药物加压诱导过程中，基因、蛋白、信号通路等变化规律，对于相关药物研究、开发意义重大。

说明书

技术领域

本发明涉及一种的耳念珠菌及其在构建氟康唑单药耐药模型中的应用。

背景技术

耳念珠菌(Candida auris)于2009年由日本首先报道(Satoh,K.；Makimura,K.；Hasumi,Y.；Nishiyama, Y.；Uchida,K.；Yamaguchi,H.Candida auris sp.nov.,a novelascomycetous yeast isolated from the external ear canal of an inpatient in aJapanese hospital.Microbiol.Immunol.2009，53，41-44，菌株编号为 DSM21092＝CBS10913＝JCM15448，cladeⅡ，东亚分支)，其生存能力强，可以长时间存活，极易造成 院内爆发性感染。目前认为耳念珠菌存在南亚进化支(cladeⅠ)、东亚进化支(cladeⅡ)、南非进化 支(cladeⅢ)、南美进化支(cladeⅣ)、伊朗进化支(cladeⅤ)五大分支。

与抗生素相比，抗真菌药物的品种本来就十分有限，可用于系统性念珠菌感染的安全有效药物就更 少。已有多个国家报道耳念珠菌临床分离株对多种抗真菌药耐药，而且耐药品种不只局限于三唑类药物， 耳念珠菌可对唑类抗真菌药如氟康唑、伏立康唑，多烯类(如两性霉素B)、棘白菌素类(如卡泊芬净) 等多种抗真菌药具有耐药性，存在多重耐药的现象，这在其他念珠菌是从未有过的，类似对多种抗生素 耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)等超级细菌，故有人把它称之为“超级病原”(Sarma,S.；Upadhyay,S. Currentperspective on emergence,diagnosis and drug resistance in Candidaauris.Infect Drug Resist 2017,10, 155-165)。国外有学者对来自五大洲16个国家(包括东亚的日本和韩国)共计742株耳念珠菌进行 meta分析，发现有44.29％对氟康唑耐药，15.46％对两性霉素B耐药，12.67％对伏立康唑耐药，3.48％ 对卡泊芬净耐药，即使新的三唑类抗真菌药艾沙康唑的耐药率也有1.53％(Osei,S.J.Candida auris:A systematicreview and meta-analysis of current updates on an emerging multidrug-resistant pathogen. Microbiologyopen 2018，7，e578)。美国CDC检测了来自5个不同国家的54株耳念珠菌，发现93％对 氟康唑耐药，35％对两性霉素B耐药，7％对棘白菌素耐药，而两性霉素B耐药在临床十分罕见；此外， 还有41％对两个种类的抗真菌药耐药(MDR)，4％对目前在临床常用的三个种类的抗真菌药(唑类、 多烯类和棘白菌素)都耐药(XDR)(Lockhart,S.R.；Etienne,K.A.；Vallabhaneni,S.；Farooqi,J.；Chowdhary, A.；Govender,N.P.；Colombo,A.L.；Calvo,B.；Cuomo,C.A.；Desjardins,C.A.etal.Simultaneous Emergence of Multidrug-Resistant Candida auris on 3ContinentsConfirmed by Whole-Genome Sequencing and EpidemiologicalAnalyses.Clin.Infect.Dis.2017，64，134-140)，使此类感染的临床治疗更为棘手，引起了全球对耳念珠 菌的高度关注。

体外耐药模型的构建是研究耐药机制的重要途径。2020年国外Jeffrey M.Rybak等研究TAC1B突 变与耳念珠菌氟康唑耐药的关系，将耳念珠菌AR0387(B8441，clade I，南亚进化支)直接接种到YPD 培养基+8mg/L或32mg/L氟康唑(FLU)，接着用RPMI培养基平板+8mg/L或32mg/L氟康唑(FLU) 培养，挑单菌落后，接种到YPD培养基+64mg/L或256mg/L氟康唑(FLU)，接着用RPMI培养基平 板+64mg/L或256mg/L氟康唑(FLU)培养挑单菌落，得到菌株：FLU-A(MIC 8mg/L)、FLU-A2(MIC 32mg/L)、FLU-B(MIC 16mg/L)、FLU-C(MIC 32mg/L)、FLU-C2(MIC 64mg/L)(Rybak,J.M.； Munoz,J.F.；Barker,K.S.；Parker,J.E.；Esquivel,B.D.；Berkow,E.L.；Lockhart,S.R.；Gade,L.；Palmer,G.E.； White,T.C.et al.Mutationsin TAC1B:a Novel Genetic Determinant of Clinical Fluconazole Resistance inCandida auris.MBio 2020，11)。参考CDC(Antifungal Susceptibility Testing andInterpretation)标准， 耳念珠菌氟康唑抗真菌的耐药株判断标准为MIC≥32μg/mL时为耐药菌株。该文献研究TAC1B突变与 耳念珠菌氟康唑耐药的相关性，选择耳念珠菌南亚进化支AR0387(B8441)氟康唑诱导，未对诱导菌 株耐药稳定性开展相关研究，未研究是否仅对氟康唑耐药(未排除是否有多重耐药的风险)。

2018年，国内报道了第一例耳念珠菌感染的临床病例，该菌株(BJCA001)对临床常用抗真菌药 物均敏感，未发现其耐药特征(表1)，并且该菌与印度和巴基斯坦等国家的分离株亲缘关系较近(Wang， X.；Bing，J.；Zheng，Q.；Zhang，F.；Liu，J.；Yue,，H.；Tao，L.；DuH；Wang,Y.；Wang，H.et al.The first isolate of Candida auris in China:clinicaland biological aspects.Emerg Microbes Infect 2018，7，93)。 截止目前，国内已确认的感染病例有18例，对耳念珠菌的研究尚属起步阶段，国内外未见耳念珠菌东 亚分支体外诱导耐药的相关研究，国内外未见耳念珠菌仅对氟康唑单药稳定耐药的体外诱导模型构建的 报道。

表1：

耳念珠菌(Candida auris)BJCA001菌株抗真菌药敏试验

注：MIC(minimal inhibitory concentration，最低抑菌浓度)(μg/mL)

发明内容

本发明的目的是一种耳念珠菌及其在构建氟康唑单药耐药模型中的应用。

上述可用于构建氟康唑单药耐药模型的耳念珠菌系采用荷兰皇家艺术与科学学院真菌多样性研究 中心(The Westerdijk Fungal Biodiversity Institute，Westerdijk真菌生物多样性研究所)保藏的耳念珠菌 东亚分支(CBS10913)菌株【此菌株在中国医学科学院病原微生物菌(毒)种保藏中心医学真菌分中 心亦有保藏，保藏编号为CAMS-CCPM-D50822】，通过氟康唑浓度递增法诱导后而得到，具体如下：

耳念珠菌(Candida auris)CAMS-CCPM-D 51242，已经于2021年11月12号保藏于位于中国北京 北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为 CGMCC NO.23790。

经测序，该耳念珠菌(氟康唑MIC

ITS1/ITS4片段序列:

GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGATATTT TGCATACACACTGATTTGGATTTTAAAACTAACCCAACGTTAAGTTCAACTAAACTATAAAGAAAA CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAGTAT GACTTGCAGACGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCTTGGGGTATTCCCCAAGGCAT GCCTGTTTGAGCGTGATGTCTTCTCACCAATCTTCGCGGTGGCGTTGCATTCACAAAATTACAGCTT GCACGAAAAAAATCTACGCTTTTTTTTCGTTTTGTTGTCGCCTCAAA

NL1/NL4片段序列:

CCAACAGGGATTGCCTCAGTaACGGCGAGTGaAGCGGCAAGAGCTCAACTTTGGAATCGCTCC GGCGAGTTGTAGTCTGGAGGTGGCCACCACGAGGTGTTCTAGCAGCAGGCAAGTCCTTTGGAACA AGGCGCCAGCGAGGGTGACAGCCCCGTACCTGCTTTTGCTAGTGCTTCCTGTGGCCCACCGACGA GTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATATTGGCGA GAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAAC AGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGCACCCAGACACGGTTTCGGCCGGGCCAGCATCA AGTAGAACGGGGTTAAAAGACCTGGGGAATGTAGCTACCTCTTGGTAGTGTTATAGCCCTTGGGTG ATGACCCCTGTTTTGCTTGAGGACAGCGGTCTCTAGGATGCTGGCGCAATGGTT

根据现有研究，耳念珠菌对抗真菌药物是否敏感或不耐药通常参考CDC(Antifungal Susceptibility Testing and Interpretation)标准，耳念珠菌氟康唑测定MIC≥32μg/mL时为氟康唑耐药菌株；两性霉素B 测定MIC≥2μg/mL时为两性霉素B耐药菌株；阿尼芬净测定MIC≥4μg/mL时为阿尼芬净耐药菌株；卡 泊芬净测定MIC≥2μg/mL时为卡泊芬净耐药菌株；米卡芬净测定MIC≥4μg/mL时为米卡芬净耐药菌株。 目前行业内虽然对耳念珠菌5-氟胞嘧啶、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑抗真菌的耐药株判断暂无公 认的标准，但文献《EUCAST和CLSI比较8种抗真菌化合物对耳念珠菌微量稀释法测定的MICs值和初步的流行病学临界值》(Arendrup,M.C.,Prakash,A.,Meletiadis,J.,Sharma,C.,&Chowdhary,A. (2017).Comparison of EUCAST and CLSI reference microdilutionMICs of eight antifungal compounds for Candida auris and associated tentativeepidemiological cutoff values.Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 61,e00485–17)所披露的耐药株判断标准有重要的参考价值，根据该文献的记载，除氟康唑外的其他唑 类药物(伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑)MIC≥1μg/mL时认为不敏感。

鉴于耳念珠菌普遍存在多重耐药(同时对多种药物耐药)的情况，需排除临床常用其他药物耐药的 影响后，才能得到耳念珠菌氟康唑单药耐药模型。

基于上述现有研究，申请人对上述耳念珠菌进行了如下一系列的实验，确定此株耳念珠菌可以做为 耳念珠菌氟康唑单药耐药模型：

1、耳念珠菌单药耐药实验。

由于耳念珠菌普遍存在多重耐药(同时对多种药物耐药)的情况，研究氟康唑诱导耐药菌株对其他 药物的敏感性变化，对研究耳念珠菌耐药机制有重要意义。按照CISLM27-E4药物敏感性测定标准， 通过微量稀释法，采用临床常见药物(5-氟胞嘧啶/5-FC，米卡芬净/MFG，卡泊芬净/CAS，伏立康唑/VRC， 泊沙康唑/POS，两性霉素B/AMB，伊曲康唑/ITC，阿尼芬净/AFG等)测MIC

2、耐药子代对氟康唑耐药稳定性试验：

将本发明所涉及的耳念珠菌菌株传代到YPD固体培养基上(平板或者斜面)，长出后用YPD液体 培养基活化，24-48h传代1次，传代10次左右，得到氟康唑耐药子代。参考CLSI标准M27-E4方案， 测定菌株MIC

3、药物处理前后的生长曲线：

采用丹麦BioSense微生物生长动态监测系统(oCelloScope

4、菌株质谱鉴定：

将本发明所涉及的菌株按照1～5×10

5、菌株显微镜下拍照观察。

本发明具有如下优点和进步：

国内外仅见对氟康唑体外诱导耐药耳念珠菌(南亚分支)的几株菌株开展相关研究，但未对诱导菌 株耐药稳定性开展相关研究，未研究是否仅对氟康唑耐药(未排除是否有多重耐药的风险)，本申请采 用耳念珠菌东亚分支(CBS10913)，通过氟康唑浓度递增法诱导后而得1株对氟康唑耐药程度不同的 菌株，通过实验排除多重耐药的风险，获得耳念珠菌氟康唑单药耐药模型；

该耳念珠菌氟康唑单药耐药模型可以研究氟康唑药物加压诱导过程中，基因、蛋白、信号通路等变 化规律，寻找耳念珠菌对氟康唑敏感和耐药的关键因子和相应机制，后续为临床研究做铺垫；

该耳念珠菌氟康唑单药耐药模型排除多重耐药的风险，后续研究找到的关键因子和相应机制与氟康 唑单药耐药相关，排除其他药物途径的干扰，对于相关药物研究、开发意义重大。

附图说明

图1为采用BioSense微生物生长动态监测系统(TANormalized算法)观察的各菌株在64μg/mL氟 康唑处理前后的生长曲线图，其中：

图1A采用的是不加药的1640培养基(A1-A3)，图1B采用的是加64μg/mL氟康唑的1640培养 基(H1-H3)。

图1中：

A1，H1是对照菌株CBS10913(CAMS-CCPM-D 50822，氟康唑MIC

A2，H2是本发明所述耳念珠菌CAMS-CCPM-D 51242(CGMCC NO.23790，氟康唑MIC

A3，H3是对照菌株CBS12372(CAMS-CCPM-D 50825，氟康唑MIC

图2是采用BioSense微生物生长动态监测系统(TANormalized算法)所观察的各菌株在不同浓度 氟康唑处理前后的生长曲线图，其中：

图2(1)中的A1-H1是对照菌株CBS10913(CAMS-CCPM-D 50822，氟康唑MIC

图2(2)中的A2-H2是本发明所述耳念珠菌CAMS-CCPM-D 51242(CGMCC NO.23790，氟康唑 MIC

图2(3)中的A3-H3是对照菌株CBS12372(CAMS-CCPM-D 50825，氟康唑MIC

图3是各菌株的质谱图，其中：

图3(1)是对照菌株CBS10913(CAMS-CCPM-D 50822，氟康唑MIC

图3(2)是本发明所述耳念珠菌CAMS-CCPM-D 51242(CGMCC NO.23790，氟康唑MIC

图3(3)是对照菌株CBS12372(CAMS-CCPM-D 50825，氟康唑MIC

图4各菌株显微镜下形态照片，其中：

图4(1)是对照菌株CBS10913(CAMS-CCPM-D 50822，氟康唑MIC

图4(2)是本发明所述耳念珠菌CAMS-CCPM-D 51242(CGMCC NO.23790，氟康唑MIC

图4(3)是对照菌株菌株CBS12372(CAMS-CCPM-D 50825，氟康唑MIC

具体实施方式

1、氟康唑单药耐药模型的确定：

为了排除耳念珠菌普遍存在的多重耐药情况，对于本发明所涉及的耳念珠菌以及对照菌株，采用临 床常见药物(5-氟胞嘧啶，米卡芬净，卡泊芬净，伏立康唑，泊沙康唑，两性霉素B，伊曲康唑，阿尼 芬净)测MIC

表2：

耳念珠菌(Candida auris)抗真菌药敏试验

表2检测数据表明：

1)参考CDC(Antifungal Susceptibility Testing and Interpretation)标准，本申请所涉及的耳念珠菌 CAMS-CCPM-D 51242(CGMCC NO.23790，氟康唑MIC

2)本申请所涉及的耳念珠菌CAMS-CCPM-D 51242(CGMCC NO.23790，氟康唑MIC

3)本申请所涉及的耳念珠菌CAMS-CCPM-D 51242(CGMCC NO.23790，氟康唑MIC

实验结果发现，本发明所述耳念珠菌CAMS-CCPM-D 51242(CGMCC NO.23790，氟康唑MIC

2、耐药子代对氟康唑耐药稳定性试验：

将本发明所涉及的耳念珠菌CAMS-CCPM-D 51242(CGMCC NO.23790，氟康唑MIC

表3：

耳念珠菌(Candida auris)氟康唑药敏试验

3、药物处理前后的生长曲线。

3.1、采用丹麦BioSense微生物生长动态监测系统(oCelloScope

如图1(A)所示，在不加药的1640培养基中，各菌株(包括本发明所述的耳念珠菌和两株对照菌 株)均可以正常生长。

如图1(B)所示，在64μg/mL氟康唑+1640培养基处理后，对比氟康唑敏感菌株CBS10913(50822) 和氟康唑耐药菌株CBS12372(50825)，本发明所述的耳念珠菌CAMS-CCPM-D 51242(CGMCC NO.23790，氟康唑MIC

3.2、采用丹麦BioSense微生物生长动态监测系统(oCelloScope

将各株菌分别做8种处理(A组-H组)，分别为A组：CK组，1640培养基；B组：1μg/mL氟康 唑+1640培养基；C组：2μg/mL氟康唑+1640培养基；D组：4μg/mL氟康唑+1640培养基；E组：8μg/mL 氟康唑+1640培养基；F组：16μg/mL氟康唑+1640培养基；G组：32μg/mL氟康唑+1640培养基；H 组：64μg/mL氟康唑+1640培养基。

相应的菌株标记为：菌株1(A1-H1)：CBS10913(CAMS-CCPM-D 50822，氟康唑MIC

如图2所示，发现与氟康唑敏感菌株CBS10913(50822)和氟康唑耐药菌株CBS12372(50825) 相比，本发明所述的耳念珠菌CAMS-CCPM-D 51242(CGMCC NO.23790，氟康唑MIC

4、菌株质谱鉴定：将各菌株按照1×10

5、菌株形态观察：对各菌株进行显微镜下拍照观察，如图4。

本实施例的各项试验表明，本发明所述耳念珠菌【(Candida auris)CAMS-CCPM-D51242(CGMCC NO.23790，氟康唑MIC