褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因及其dsRNA

摘要

本发明公开了一种褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因，如SEQ ID NO:3所示；还公开了褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsRNA，其序列如SEQ ID NO:6所示；还公开了dsRNA的合成方法：提取褐色橘蚜的总RNA，反转录成为cDNA作为扩增模板，以序列为SEQ ID NO:4的上游引物和以序列为SEQ ID NO:5的下游引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳后回收产物，以胶回收产物为模板合成得到褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsRNA。本发明首次鉴定得到褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因序列，提供的dsRNA基因沉默效率高，在研发新型杀虫剂方面有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫的生长发育调控和基因工程技术领域，特别涉及一种褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因及其dsRNA。

背景技术

褐色橘蚜Aphis citricidus是柑桔衰退病病毒Citrus tristeza virus的主要传播媒介，该病毒对世界柑桔产业造成严重的经济损失。褐色橘蚜应对逆境胁迫时出现典型的翅型可塑性，如：拥挤条件下，褐色橘蚜分化出有翅型，正常条件下褐色橘蚜为无翅型。翅型可塑性作为褐色橘蚜重要的生态对策与其爆发成灾及传播植物病毒密切相关。褐色橘蚜田间营孤雌生殖、加之有翅率高(约20％)、翅型可塑性强，世代历期短、繁殖率高等特点，使用化学药剂防治较为困难并且极易引起抗药性等问题(Shilts et al.,2018；Gao et al.,2021)。阐明褐色橘蚜翅型可塑性的分子调控机制，探索蚜虫防控的新靶标、寻获新型高效的蚜虫绿色防控技术是国内外的重大科技需求。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默手段，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA，Double-stranded RNA，双链核糖核酸)诱发的、同源RNA高效特异性降解的现象，是通过dsRNA的介导特异性的降解对应序列的mRNA。由于使用RNAi技术可以特异性抑制特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和基因治疗领域。

β-胡萝卜素调控昆虫黑化、视觉体色、抗逆胁迫等重要生理进程(Heath et al.,2013；Tougeron et al.,2021)。β-胡萝卜素是昆虫体内含量最高的类胡萝卜素(含40碳的碳氢化合物和氧化衍生物)(Ding et al.,2020；Maoka,2020)。β-胡萝卜素参与粉纹夜蛾Trichoplusia ni的黑化反应，并调节其生长速率(Clark and Lampert,2018)。此外，β-胡萝卜素通过酶催化作用转变成维生素A，并调控昆虫的视觉功能，缺乏β-胡萝卜素会导致家蚕五龄幼虫单眼和成虫复眼对由光刺激产生的电反应能力丧失(Shimizu and Kato,1981)。β-胡萝卜素响应逆境胁迫因子诱导昆虫体色可塑性(Tsuchida,2016；Wybouw etal.,2019；孙明霞等,2020)。豌豆蚜红色型与绿色型间β-胡萝卜素含量差异较大，随着寄主营养条件变差，β-胡萝卜素含量显著降低，种群适合度降低(Ding et al.,2020)；东亚飞蝗Locusta migratoria散居型呈现均匀绿色，群居型则呈现黑色背板和棕色腹面。进一步解析发现，飞蝗主要通过β-胡萝卜素与其结合蛋白的分离与结合调控体色变化(Yang etal.,2019)。申请人前期研究发现，胰岛素信号通路调控褐色橘蚜翅可塑性(Ding et al.,2017)，并发现其上游调控因子miR-9b(Shang et al.,2020)。

蚜虫通过真菌水平基因转移(Horizontal gene transfer)自身合成β-胡萝卜素。研究发现，大多数昆虫不能从头合成β-胡萝卜素，只能从食物中摄取或由体内共生微生物提供(Jeremy et al.,2013)。如家蚕Bombyx mori取食桑叶获得β-胡萝卜素，色素物质被中肠吸收后先进入血液，随后透过丝腺被丝胶蛋白吸收，从而使蚕茧着色；烟粉虱Bemisiatabaci初级共生菌Candidatus Portiera aleyrodidarum基因组中包含β-胡萝卜素生物合成关键基因，调控自身和共生宿主β-胡萝卜素的生物合成(Santos-Garcia et al.,2012；Sloan and Moran,2012)。近年来研究发现，部分刺吸式昆虫(螨)通过水平基因转移从真菌中获得相关基因合成β-胡萝卜素(Altincicek et al.,2012；Nováková and Moran,2012；Cobbs et al.,2013；Bryon et al.,2017)。在豌豆蚜Acyrthosiphon pisum基因组中发现真菌水平转移的编码脱氢酶和合成/环化酶的基因，均是β-胡萝卜素生物合成所必需的基因(Moran and Jarvik,2010)，该发现为昆虫β-胡萝卜素生物合成与功能研究开辟了新领域。随后在其它蚜虫、二斑叶螨Tetranychus urticae和黑森瘿蚊Mayetiola destructor基因组中也发现了真菌转移β-胡萝卜素生物合成相关基因的现象(Altincicek et al.,2012；Cobbs et al.,2013；Bryon et al.,2017)。

β-胡萝卜素通路关键酶系在不同物种中差异巨大(Miziorko et al.,2011；Sunet al.,2018；Ma et al.,2022)。两个牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)分子在合成酶的作用下生成八氢番茄红素。在植物、藻类和细菌中，该酶仅具有合成酶功能(Sieiro et al.,2003)。而在真菌中，合成酶为双功能酶，既具有合成酶功能，又具有环化酶功能(Velayoset al.,2000；Arrach et al.,2001)。八氢番茄红素在脱氢酶的作用下脱氢生成番茄红素。在真菌和真细菌中，这一过程由一个脱氢酶基因催化生成，而在植物和藻类生物中这一过程则由不同的酶系分工完成(Sandmann et al.,2009)。环化酶可使番茄红素的一端或者两端发生环化作用，生成β-胡萝卜素、α-胡萝卜素和γ-胡萝卜素(Maoka et al.,2020)，β-胡萝卜素则在加氧酶(NinaB)和β-胡萝卜素结合蛋白(β-CBP)的作用下形成复合物并进一步代谢成其他色素或能量物质(Clark et al.,2018；Chai et al.,2019；Yang et al.,2019)。分析34种蚜虫相关序列发现，脱氢酶、合成酶和环化酶基因是在蚜虫进化早期获得，经过不断的复制、重组和筛选，从而在不同种类的蚜虫中扩张或收缩出不同的基因，呈现多样化的β-胡萝卜素通路(Nováková and Moran,2012；Takemura et al.,2021)。

类胡萝卜素加氧酶(Carotenoid Oxygenase)能够氧化裂解类胡萝卜素产生维生素A(Vitamin A,VA)类物质。该酶作为一种可溶于细胞质中的重要酶类，在肠黏膜尤其空肠黏膜细胞中的活性最高。目前针对褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶蛋白的相关研究较少，也未见针对褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsRNA的报道。

发明内容

本发明针对褐色橘蚜β-胡萝卜素通路解析及其对翅型可塑性的调控作用这一关键科学问题，在系统鉴定褐色橘蚜β-胡萝卜素通路基因的基础上，运用RNAi在活体水平上构建褐色橘蚜β-胡萝卜素的通路；解析褐色橘蚜β-胡萝卜素通路响应逆境胁迫的表达模式；分析β-胡萝卜素对褐色橘蚜翅型可塑性的影响及胰岛素对β-胡萝卜素通路的调控。

本发明经过研究验证首次鉴定到了褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因(AcNinaB基因)，并设计合成其dsRNA，通过实验验证，该dsRNA基因沉默效率高。基于此，本发明保护如下技术方案：

一种褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

上述的褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因或褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因编码的蛋白作为靶标在如下任一中的应用：

1)在调控褐色橘蚜翅型可塑性或制备调控褐色橘蚜翅型可塑性的产品中的应用；

2)在调控褐色橘蚜生长发育或制备调控褐色橘蚜生长发育调控剂中的应用；

3)在防治褐色橘蚜或制备防治褐色橘蚜的产品中的应用。

本发明还保护扩增上述的褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还保护上述的褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的PCR扩增方法，包括如下步骤：以褐色橘蚜总RNA反转录得到的cDNA为模板，以序列为SEQ ID NO:1的上游引物和以序列为SEQ ID NO:2的下游引物进行PCR扩增。

在上述的PCR扩增方法中，当PCR扩增的反应体系为25μl时，25μl的PCR反应体系包括：浓度为200-700ng/μl的cDNA模板1μl，浓度为0.15-0.25μM的上下游引物各1μl，DNA聚合酶LA Taq MIX 0.25μl，10×Buffer(Mg

PCR条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃条件下延伸10min。

本发明还保护一种褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsRNA，以如SEQ ID NO:3所示的褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因片段为模板转录获得。

优选地，所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

上述的褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsRNA在如下任一中的应用：

1)在调控褐色橘蚜翅型可塑性或制备调控褐色橘蚜翅型可塑性的产品中的应用；

2)在调控褐色橘蚜生长发育或制备调控褐色橘蚜生长发育调控剂中的应用；

3)在防治褐色橘蚜或制备防治褐色橘蚜的产品中的应用。

本发明还保护一种褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsRNA的合成方法，包括如下步骤：以褐色橘蚜总RNA反转录得到的cDNA为模板，以序列为SEQ ID NO:4的上游引物和以序列为SEQ ID NO:5的下游引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳后回收产物，以胶回收产物为模板合成得到褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsRNA。

在上述的褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsRNA的合成方法的技术方案中，dsRNA合成反应体系为20μl，其中包括：胶回收得到的片段模板4μl(约1μg)、5×TranscrptAid Reaction Buffer 4μl、浓度为100mM的ATP/CTP/GTP/UTP Mix 8μl、TranscriptAid Enzyme Mix 2μl和DEPC-treated water 2μl；反应条件为：37℃孵育4h。

本发明的有益效果是：本发明首次鉴定得到褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因序列，并通过实验验证该基因参与调控褐色橘蚜翅型可塑性，根据该序列得到类胡萝卜素加氧酶基因的dsRNA，可以应用于对褐色橘蚜进行RNA干扰从而起到防治褐色橘蚜的效果。通过实验验证，该dsRNA基因沉默效率高，基因干扰后褐色橘蚜有明显表型变化，解决了褐色橘蚜目前没有有效的类胡萝卜素加氧酶基因的dsRNA的问题，在研发新型杀虫剂方面有很好的应用前景。

附图说明

图1为褐色橘蚜AcNinaB基因在NCBI中Protein Blast比对图。

图2为褐色橘蚜AcNinaB基因氨基酸序列与其它昆虫AcNinaB蛋白系统发育树图。

图3为本发明实施例中的饲喂dsRNA的装置。

图4为褐色橘蚜有翅型和无翅型类胡萝卜素组分和含量分析。

图5为褐色橘蚜β-胡萝卜素通路基因在种群密度变化(A)和翅二型(若虫(B)和成虫(C))中表达差异。

图6干扰胰岛素受体基因2(InR2)对β-胡萝卜素通路基因表达量(A)和含量的影响(B)。

图7为褐色橘蚜饲喂AcNinaB基因的dsRNA后的AcNinaB基因相对表达量，其中dsGFP表示对照组，dsAcNinaB表示实验组。

图8为褐色橘蚜饲喂AcNinaB基因的dsRNA后的有翅率，其中dsGFP表示对照组，dsAcNinaB表示实验组。

图9为褐色橘蚜饲喂AcNinaB基因的dsRNA后的β-类胡萝卜素含量检测结果。

图10为褐色橘蚜饲喂AcNinaB基因的dsRNA后表型表现图；其中1为对照组的正常褐色橘蚜，2为实验组的翅发育不正常的褐色橘蚜。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用化学、生物试剂，如无特殊说明，均为本领域常规试剂。

本发明实施例中主要化学试剂来源如下：

LA Taq MIX(Takara公司,日本)

TRIzol kit(Invitrogen公司，美国)

RNeasy Plus Micro Kit(QIAGEN公司，德国)

PrimeSTAR Max Premix(Takara公司,日本)

胶回收纯化试剂盒(Takara公司,日本)

Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo fisherScientific公司，美国)

Perfect real time RT reagent(Takara公司，日本)

TranscriptAid Enzyme Mix(Thermo fisher Scientific公司，美国)

ATP/CTP/GTP/UTPMix(Thermo fisher Scientific公司，美国)

PrimeScriptRT Enzyme Mix I(Thermo fisher Scientific公司，美国)

Oligo dT Primer(Thermo fisher Scientific公司，美国，AM5730G)

Random 6mers(Thermo fisher Scientific公司，美国，SO142)

实施例一、褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因序列鉴定

1)从褐色橘蚜基因组数据(西南大学昆虫学与害虫控制重点实验室内部数据库)中查找可能的类胡萝卜素加氧酶序列，通过tBlastn，在基因组当中查找到一条序列，使用在线软件https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，通过Primer-BLAST设计引物：

PCR product size：Min：250，Max：500；Organism：Aphidoidea，得到引物序列。通过对设计得到的引物在软件DNAMAN中进行自身互补性检验和自由能检验：引物结构最小自由能＝0.00千卡/摩，不存在自身互补性，两引物互补性中Max complementarity incontinuous:4bp,free energy＝-1.60Kcal/mol，Max complementarity indiscontinuous:7bp得到引物AcNinaB-A(如SEQ ID NO:1所示)和AcNinaB-S(如SEQ ID NO:2所示)PCR引物。

PCR product size：Min：150，Max：300；Organism：Aphidoidea，得到引物序列。通过对设计得到的引物在软件DNAMAN中进行自身互补性检验和自由能检验：引物结构最小自由能＝0.00千卡/摩，不存在自身互补性，两引物互补性中Max complementarity incontinuous:4bp,free energy＝-3.30Kcal/mol，Max complementarity indiscontinuous:7bp得到引物为AcNinaB-L(如SEQ ID NO:9所示)和AcNinaB-R(如SEQ IDNO:10所示)。

2)利用RNA提取试剂盒RNeasy Plus Micro Kit按照使用说明提取褐色橘蚜的总RNA，然后利用反转录试剂盒Perfect real time RT reagent按照使用说明将1μg总RNA反转录成为cDNA。

3)以上述得到的cDNA为模板，设计全长扩增引物，利用上下游引物AcNinaB-A和AcNinaB-S进行PCR扩增；PCR条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、60℃退火10s、72℃延伸2min，共35个循环；72℃条件下延伸10min。PCR反应体系共25μl，包括：浓度为400-500ng/μl的cDNA模板1μl，浓度为0.15-0.25μM的上下游引物各1μl，DNA聚合酶LA Taq MIX 0.25μl，10×Buffer(Mg

AcNinaB-A：TCGCTGCTAAGAAACGGTCC，

AcNinaB-S：ACAATACCAGCCATCCGAGC。

4)将PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳中进行分离，得到1830bp左右的条带，将PCR产物送测序公司进行测序，测序结果如SEQ ID NO:3所示。

5)将测序结果通过手工校对，序列拼接，并在NCBI中进行Protein Blast相似性比对，比对结果如图1所示，可见扩增得到的基因片段与棉蚜(Aphis gossypii)NinaB基因(类胡萝卜素加氧酶基因)同源性最高，高达96％。与其他昆虫比对结果也发现，可与其他昆虫的NinaB基因比对上，说明本克隆获得的基因应为褐色橘蚜AcNinaB基因。

6)通过氨基酸系统发育树的构建，如图2所示，系统发育树分析表明，褐色橘蚜NinaB基因基因与半翅目其他昆虫的NinaB基因相聚集，说明褐色橘蚜的NinaB基因与半翅目其他昆虫以及其他目昆虫的NinaB基因高度同源。

实施例二、褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsRNA的合成

1)在AcNinaB-A(如SEQ ID NO:1所示)和AcNinaB-S(如SEQ ID NO:2所示)序列5’端添加T7启动子序列，设计扩增合成类胡萝卜素加氧酶酶(NinaB)基因的上下游引物T7-AcNinaB-A1(如SEQ ID NO:4所示)、T7-AcNinaB-S1(如SEQ ID NO:5所示)，合成引物，引物序列分别为：

T7-AcNinaB-A1：TAATACGACTCACTATAGGGTCGCTGCTAAGAAACGGTCC，

T7-AcNinaB-S1：TAATACGACTCACTATAGGGACAATACCAGCCATCCGAGC。

2)利用RNA提取试剂盒RNeasy Plus Micro Kit按照使用说明提取褐色橘蚜的总RNA，然后利用反转录试剂盒Perfect real time RT reagent按照使用说明将1μg总RNA反转录成为cDNA，反转录体系为20μl，其中包括：total RNA 1μl(约1μg)，5×PrimeScriptBuffer 4μl，PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1μl，Oligo dT Primer(50μM)1μl，Random6mers(100μM)1μl，RNase Free ddH

3)对步骤2)得到的cDNA进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、60℃退火10s、72℃延伸2min，共35个循环；72℃条件下延伸10min；PCR反应体系共25μl，包括：浓度为400-500ng/μl的cDNA模板0.5μl，浓度为0.15-0.25μM的上下游引物(T7-AcNinaB-A1、T7-AcNinaB-S1)各1μl，PrimeSTAR Max Premix 12.5μl以及去核酸酶水10μl。

4)将步骤3)中的PCR产物用胶回收纯化试剂盒按照说明书纯化回收之后作为合成dsRNA的转录模板，用体外合成RNA试剂盒Transcript Aid T7 High Yield TranscriptionKit按照使用说明转录合成并纯化得到褐色橘蚜AcNinaB基因的dsRNA(如SEQ ID NO:6所示)溶液，将dsRNA溶液浓度稀释到200-300ng/μl备用。dsRNA合成反应体系为20μl，其中包括：胶回收得到的片段模板4μl(约1μg)、5×TranscrptAid Reaction Buffer 4μl、浓度为100mM的ATP/CTP/GTP/UTP Mix 8μl、TranscriptAid Enzyme Mix 2μl和DEPC-treatedwater 2μl；反应条件为：37℃孵育4h。

同时按照上述方法合成并纯化得到GFP(绿色荧光蛋白)的dsRNA溶液作为阴性对照，反转录得到的cDNA进行PCR扩增时使用的上下游引物序列分别为GFP-ds-T7F(如SEQ IDNO:7所示)、GFP-ds-T7R(如SEQ ID NO:8所示)，序列为：GFP-ds-T7F：

TAATACGACTCACTATAGGGCAGTTCTTGTTGAATTAGATG；

GFP-ds-T7R：

TAATACGACTCACTATAGGGTTTGGTTTGTCTCCCATGATG。

实施例三、褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsRNA导入褐色橘蚜

利用如图3所示的装置对褐色橘蚜饲喂dsRNA，按照如下步骤操作：

1)取干净的50mL离心管，用剪刀将离心管1圆锥形底部剪去，取250μl PCR管2将管底剪掉，用双面胶将PCR管2的管口与离心管1管盖的内壁粘在一起，使得PCR管2套在离心管1内；

2)从PCR管2剪掉的管底处伸入移液枪注入上述制得的dsRNA溶液，将离心管1管底朝上地竖立放置；

3)取新鲜的柑橘嫩梢3，用无核酸酶水清洗干净吸干多余水分后插入PCR管2的dsRNA溶液中，然后用封口胶缠住PCR管2剪掉管底后留下的缺口，防止随后放入的褐色橘蚜进入PCR管2中；

4)将20头褐色橘蚜挑入离心管1中，用5cm*5cm的80目纱网4盖住离心管1的管底，并用橡皮筋捆紧纱网4，保证褐色橘蚜正常呼吸同时防止其逃出离心管1；将该整个饲喂dsRNA的装置放入培养箱中，在25±1℃、湿度75±5％和光照:黑暗为14h:10h的条件下培养72h。

每20头褐色橘蚜为一个生物重复，设置4个饲喂AcNinaB基因dsRNA溶液的生物重复作为实验组。同时设置饲喂GFP的dsRNA溶液的处理作为对照组。

实施例四、AcNinaB影响褐色橘蚜翅型分化研究

翅型可塑性是翅二型昆虫应对不良栖息环境的反应(Vellichirammal et al.,2017；Parker and Brisson,2019；Reyes et al.,2019；Hammelman et al.,2020)，如飞虱和蟋蟀的长翅型与短翅型，蚜虫的有翅型和无翅型等(袁一杨等,2020；Parker et al.,2021；Zhang et al.,2021)。种群密度变化是影响昆虫翅型可塑性的重要逆境胁迫因子(Hayes et al.,2019；Richard et al.,2019；Zhang et al.,2019；何衍彪等，2021)。

一、有翅型和无翅型褐色橘蚜β-胡萝卜素含量差异分析

参照(Ding et al.,2021Parental silencing of a horizontally transferredcarotenoid desaturase gene causes a reduction of red pigment and fitness inthe pea aphid,Pest Management Science,76:2423-2433)的方法进行。分别挑取有翅若蚜(三龄、四龄)、有翅成蚜(高种群密度饲养)和无翅若蚜(三龄、四龄)、无翅成蚜(低种群密度饲养)，称重后提取β-胡萝卜素，检测和比较翅二型褐色橘蚜β-胡萝卜素含量差异，每组设置4个生物重复，每个重复30头。将称重后的褐色橘蚜样品置于1.5mL离心管中，加入500μL 60％无水乙醇充分研磨，避光条件下超声处理30min。加入500μL正己烷萃取β-胡萝卜素。剧烈震荡后12,000g，4℃离心彻底分离含有β-胡萝卜素的正己烷层和下层乙醇提取液。转移上层提取液至新的离心管中，利用干燥浓缩仪避光浓缩后加入50μLMTBE充分溶解β-胡萝卜素，离心后吸取上清，用滤膜过滤除菌，HPLC检测β-胡萝卜素含量变化，采用YMC(Wilmington，NC，USA)C30β-胡萝卜素专用色谱柱，进样体积为10μL，柱温为40℃，流速为0.3mL/min，流动相A为乙腈:甲醇＝3:1，流动相B为100％MTBE，采用梯度洗脱，根据峰面积和β-胡萝卜素标品的标准曲线计算β-胡萝卜素含量。

通过HPLC比较褐色橘蚜有翅型和无翅型类胡萝卜素的组成和含量差异发现，无翅成蚜中有2种类胡萝卜素(出峰时间为20.49和37.14)显著高于有翅成蚜；结合已有的β-胡萝卜素标品的峰谱图可知，出峰时间为37.14的物质为β-胡萝卜素，另一物质尚未得到鉴定。结果表明β-胡萝卜素丰度在两种翅型褐色橘蚜间存在显著性差异，说明其参与调控褐色橘蚜翅型可塑性(图4)。

二、逆境胁迫对β-胡萝卜素通路基因的调控解析

参照(Shang et al.,2020The miR-9b microRNA mediates dimorphism anddevelopment of wing in aphids,Proceedings of the National Academy ofSciences.117(15):8404-8409)的方法。在申请人前期发现种群密度变化可以显著诱导褐色橘蚜翅型可塑性的基础上(Shang et al.,2020)，本实验以种群密度变化为关键逆境胁迫因子，挑取刚蜕皮的无翅成蚜开展实验。分别按照种群密度：10头/皿(低密度)和80头/皿(高密度)处理24h后收集样品，每个处理4个生物重复。研磨后使用Trizol法提取总RNA，以反转录的cDNA为模板，使用NovoStart SYBR qPCR SuperMix进行RT-qPCR扩增，以EF1α和β-act作为内参，使用qBASE计算种群密度变化对β-胡萝卜素生物合成基因(5个合成/环化酶基因(CscA、CscB、CscC、CscD、CscE)，2个脱氢酶基因(CdeA和CdeB)的转录调控。

当母代褐色橘蚜种群密度增大时，其后代有翅率显著升高。以种群密度作为环境胁迫因子研究β-胡萝卜素通路基因的转录调控，分析有翅和无翅若蚜以及有翅和无翅成蚜的表达差异发现，褐色橘蚜CscE和CdeB均在拥挤阶段和有翅成蚜中高表达，而CscD则在拥挤阶段和有翅若蚜表达量下调。同时β-胡萝卜素加氧酶(NinaB)和β-胡萝卜素结合蛋白(β-CBP)均在拥挤和有翅蚜中表达量上调(图5)。结合HPLC结果表明，β-胡萝卜素通路与褐色橘蚜翅型可塑性密切相关。

三、胰岛素活性对β-胡萝卜素通路基因表达及含量的调控

参照(Takemura et al.,2021,Elucidation of the whole carotenoidbiosynthetic pathway of aphids at the gene level and arthropodal food chaininvolving aphids and the red dragonfly.BMC Zoology.6:1-13.和Sun et al.,2021,Biosynthesis of aphid alarm pheromone is modulated in response to starvationstress under regulation by the insulin,glycolysis and isoprenoidpathways.Journal of Insect Physiology.128,104174.)的方法。使用RNA干扰关键基因InR2作为胰岛素活性的指示因子。合成InR2的dsRNA并用无核酶水稀释至800ng/mL。将柑桔嫩梢分别插入装有以上的1.5mL离心管中，持续饲喂24和48h后收集试虫，检测基因表达量和β-胡萝卜素含量变化，以饲喂dsGFP为对照，每组4个生物重复。

成功干扰褐色橘蚜胰岛素受体基因2(InR2)发现，β-胡萝卜素通路基因表达量发生变化，NinaB和β-CBP显著上调，导致β-胡萝卜素代谢加快，含量降低(图6)，说明β-胡萝卜素通路确实受胰岛素活性的调控。

实施例五、沉默效率以及表型的检测

实施例三中饲喂dsRNA的装置在培养箱中培养72小时后，收集上述AcNinaB基因的dsRNA溶液处理过的实验组，以及GFP的dsRNA溶液处理的对照组的褐色橘蚜，使用TriZol法分别提取RNA之后利用Perfect real time RT reagent反转录得到相应的cDNA，反转录体系为20μl，其中包括：总RNA 1μl(约1μg)，5×PrimeScript Buffer 4μl，PrimeScriptRTEnzyme Mix I 1μl，Oligo dT Primer(50μM)1μl，Random 6mers(100μM)1μl，RNase FreeddH

利用qRT-PCR技术，检测AcNinaB基因在实验组、对照组中的相对表达量。qPCR中实验组的上下游引物为AcNinaB-L(如SEQ ID NO:9所示)和AcNinaB-R(如SEQ ID NO:10所示)，对照组的上下游引物为GFP-ds-F(如SEQ ID NO:11所示)和GFP-ds-R(如SEQ ID NO:12所示)，引物序列如下：

AcNinaB-L：CCATTAAGTGTCGGTGGCCT；

AcNinaB-R：TGCTCCGTTATGCCGAAAGA；

GFP-ds-F：CAGTTCTTGTTGAATTAGATG；

GFP-ds-R：TTTGGTTTGTCTCCCATGATG。

qRT-PCR反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s、60℃退火30s，共40个循环。PCR反应体系为20μl，包括：cDNA模板1μl(250ng)，前述上下游qPCR引物各1μl，去核酸酶水7μl和荧光染料

EF1A-S:GATGCACCTGGTCACAGAGA，如SEQ ID NO:13所示；

EF1A-A:CCATCTTGTTCACACCAACG，如SEQ ID NO:14所示。

qRT-PCR检测结果显示，褐色橘蚜的类胡萝卜素加氧酶基因(AcNinaB基因)在饲喂相应的dsRNA的实验组中的相对表达量相对于对照组(GFP)显著下调，而且下调高达50％左右，如图7所示。同时，通过观察发现，类胡萝卜素加氧酶基因的dsRNA处理的实验组的褐色橘蚜后代有翅率降低至3.75％，而对照组有翅率则为43％(结果如图8所示)，β-类胡萝卜素含量上升3倍左右(结果如图9所示)。图10中1为对照组(dsGFP)的褐色橘蚜后代有翅情况，2为dsNinaB处理组的褐色橘蚜后代有翅情况，实验验证了实验组的褐色橘蚜的类胡萝卜素加氧酶基因的表达受到抑制，且AcNinaB基因参与蚜虫的翅型分化。实验结果也说明利用本发明方法对褐色橘蚜进行AcNinaB基因的dsRNA饲喂，能够有效导入dsRNA，达到RNA干扰的效果。

序列表

<110> 西南大学

<120> 褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因及其dsRNA

<160> 14

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> AcNinaB-A

<400> 1

tcgctgctaa gaaacggtcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> AcNinaB-S

<400> 2

acaataccag ccatccgagc 20

<210> 3

<211> 1809

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 褐色橘蚜AcNinaB基因

<400> 3

atgaaaaaaa cagctcggta tttttcaaag aagaaatact tattaaaaac aatattgacc 60

tctaaaatca aatcaactat taaccggtat aaaaaatgtc aattttggtt gactaagggt 120

ttgtggcgcg tcgcaaataa ttggaaagag actgcaccgg cggcgagcag aaaaacttct 180

ggaattgacg gtatgtttca aggattggac gaaaacagag acgtgttagt gaaaaggttg 240

aatgctggtc agaaattata tcccaattgt gatacatcgg tctggctaag aaactgtacg 300

catgacatac caactcccgt ccaagggaaa atcgaaggta agataccaga atggttatcg 360

ggatcgctgc taagaaacgg tccaggaagt acacaagtgg gaaattatga atttaaacat 420

atatttgaca gctctgcttt actgcacagg tttgcattca aaaatggagc agtttcatat 480

caatgtagat ttttagaatc aaatacatat aaacaaaata aagcagccca aagaattgtt 540

attaccgaat ttggaaccag agcatgtcct gatccttgta aaacaatttt tcacagggtg 600

tctaatgtat ttaaatgggg agatgatcaa tcagataatg cgatgatatc tatttaccca 660

atcggcgatg aatattatgc atttaccgag aatccaataa tgatcaaaat taatcctaca 720

actctcgaaa cacttaatac tatagatata gctcggatgg ctggtattgt tcaccatact 780

gctcacccac atatggcagc cgatggtgcg gttttcaatt tagcaactgt tccaaaaatt 840

gatggacctc attattgcgt ggttaaattt cctcgggttg attcagaaag tggatatcag 900

tattcgacgg acgaaatgtt tgggcgaatg tgcatcgtgg ctaccattaa gtgtcggtgg 960

cctctgcacc ctgggtatat gcattctttc ggcataacgg agcattattt catcatagtc 1020

gaacaacctc taagtatttc attgtcaacc gccatgatta atagattcaa aggagatcca 1080

atgtatagtg cactaaaatg gtttcaagac tgccctactc taatttactt gatttcgcga 1140

tctgatggca aaacggtgaa gacatttaaa tcagatgcat tcttttacct acatataata 1200

aaccaatatg aagaagacga taacgtagtg atcgatattt gttgttaccg agatccttcc 1260

atgattgact gcatgttcat cgaagcatta caaaatctca ataaaaaccc agattatgca 1320

gccatgtttc gcagcaggcc tttgagattt gtgttgccag ttaatcgtaa tcctactagt 1380

ggcgatatcg tgaacgagca cccgtatgtc agccccgaaa agctatgtga tttaggttgt 1440

gaaacaccca gaattaatga ctttaaaatt ggcacaaaat acagattttt ctatgcaata 1500

tcatcagatg ttgatgctga aaaccctggg acgctcatta aagtggatac gtacaataaa 1560

acttgtaaaa catggtgcga aaagaacgta tatcctagtg aaccaatttt tgtttcttcg 1620

ccggacgctg aagacgaaga cgatggtgta attttgtcat caattatttg gggtggatcg 1680

gagtgtacac acaaagctgg agtaatagtt ttggatgcaa agagttggac agagataggg 1740

cgagctattt ttatcactca gtcaccagtt cctaaatgct tacatggatg gtatgctgat 1800

gctgtttaa 1809

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> T7-AcNinaB-A1

<400> 4

taatacgact cactataggg tcgctgctaa gaaacggtcc 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> T7-AcNinaB-S1

<400> 5

taatacgact cactataggg acaataccag ccatccgagc 40

<210> 6

<211> 407

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 褐色橘蚜AcNinaB基因的dsRNA

<400> 6

tcgctgctaa gaaacggtcc aggaagtaca caagtgggaa attatgaatt taaacatata 60

tttgacagct ctgctttact gcacaggttt gcattcaaaa atggagcagt ttcatatcaa 120

tgtagatttt tagaatcaaa tacatataaa caaaataaag cagcccaaag aattgttatt 180

accgaatttg gaaccagagc atgtcctgat ccttgtaaaa caatttttca cagggtgtct 240

aatgtattta aatggggaga tgatcaatca gataatgcga tgatatctat ttacccaatc 300

ggcgatgaat attatgcatt taccgagaat ccaataatga tcaaaattaa tcctacaact 360

ctcgaaacac ttaatactat agatatagct cggatggctg gtattgt 407

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> GFP-ds-T7F

<400> 7

taatacgact cactataggg cagttcttgt tgaattagat g 41

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> GFP-ds-T7R

<400> 8

taatacgact cactataggg tttggtttgt ctcccatgat g 41

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> AcNinaB-L

<400> 9

ccattaagtg tcggtggcct 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> AcNinaB-R

<400> 10

tgctccgtta tgccgaaaga 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> GFP-ds-F

<400> 11

cagttcttgt tgaattagat g 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> GFP-ds-R

<400> 12

tttggtttgt ctcccatgat g 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> EF1A-S

<400> 13

gatgcacctg gtcacagaga 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> EF1A-A

<400> 14

ccatcttgtt cacaccaacg 20