一种用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方法及药物

摘要

本发明属于纳米硒制备技术领域，公开了一种用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方法及药物，选择牦牛源、马源的益生菌并纯化；将纯化后的益生菌接种至含亚硒酸钠的LB肉汤中，摇床培养；筛选亚硒酸钠还原率高、发酵液红色物质生成量多的菌株；将筛选的还原率高的菌株接种至LB肉汤中进行常规培养；将筛选的还原率较高的菌株在含亚硒酸钠的LB琼脂平板上划线培养，挑取红色单菌落，得到验证并筛选出最佳菌株蜡样芽孢杆菌A3；设置含亚硒酸钠的LB肉汤中硒含量浓度梯度以及培养时间梯度，选择得到最高耐受浓度以及最优培养时间，提取纳米硒球，进行表征及纯度测定。本发明的纳米硒有蛋白包被，粒径小，纯度高，稳定性更好。

说明书

技术领域

本发明属于纳米硒制备技术领域，尤其涉及一种用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方法及药物。

背景技术

目前：硒(Se)是一种对生物系统有广泛影响的微量元素，它作为组成谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性中心的重要元素，在清除ROS及其衍生物的细胞抗氧化防御机制中发挥着重要作用。周驰利用生防菌枯草芽孢杆菌和亚硒酸钠溶液反应，制备了粒径范围50～250nm的纳米硒；车林利用Acillus cereus CC-1和亚硒酸钠溶液反应，制备了粒径范围100～250nm的纳米硒。相较于目前生产中广泛使用的有机硒(酵母硒、硒代蛋氨酸等)、无机硒(亚硒酸钠)而言，纳米硒具有更高活性、更高安全性、更强抗氧化性的特点。

然而现有的物理源或化学源纳米硒容易转化成黑色或褐色纳米硒，且制备过程对环境和生物不友好。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的物理制备纳米硒的方法实验条件和成本较高，而化学制备纳米硒的方法制备过程易对环境造成污染不友好；同时物理方法制备的纳米硒容易转化成黑色或褐色纳米硒，从而降低其生物学效应不稳定。蒸发和激光烧蚀技术是仪器方法的例子，通常用于纳米粒子的合成。在化学技术中，使用添加剂、溶剂和稳定剂，如硼氢化物、乙胺、十二烷酸酯和许多其他化学物质。这些化学物质不环保，有害，对生物有毒。

解决以上问题及缺陷的意义为：一方面可以降低制作成本，另一方面可以增加其稳定性，并且更加环保。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方法及药物。

本发明是这样实现的，一种用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方法，所述用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方法包括：

采用牦牛源的益生菌利用微生物还原法进行纳米硒的制备。

进一步，所述用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方法包括以下步骤：

步骤一，选择6株来自牦牛源、马源的益生菌，并对选择的6株益生菌进行纯化；将纯化后的益生菌按1％的接种量接种至含有3、6、12、18、24、30mmol/L 硒元素的LB肉汤培养基中常规培养；

步骤二，根据细菌发酵液的颜色，试管底部的红色沉淀多少，以及DAB法测量得到的亚硒酸钠还原率筛选出最佳菌株；

步骤三，将筛选的菌株在含3、6、12、18、24、30mmol/L亚硒酸钠的LB 琼脂平板上划线培养，挑取红色单菌落，重复3次液体发酵、琼脂平板划线，验证菌株；

步骤四，将选出的菌株按1％的比例接种至含有18、20、22.5、24mmol/L 亚硒酸钠的LB肉汤中进行浓度筛选。选出最适浓度后，将菌株按1％的比例接种至含有最适浓度亚硒酸钠的LB肉汤中培养12、24、48、72、96、120h进行时间筛选；

步骤五，将筛选出的菌株在LB肉汤中摇床培养至OD600为0.7时按1％的比例接种至含亚硒酸钠最佳浓度的LB肉汤中，在37℃，180r/min的条件下培养最适时间；

步骤六，将培养好的菌液在4℃，13000r/min离心10min，弃去上清。将沉淀用0.9％NaCl清洗三次，每次在12000r/min离心8min。清洗后将沉淀置于无菌研钵中，加入液氮研磨。研磨后用少量无菌水重悬，然后在在冰浴、功率为 100W的条件下超声处理10min，在4℃、12000r/min离心10min并收集沉淀物。用含1％SDS的1.5mol/LTris-HCl(pH 8.3)离心洗涤(4℃，12000r/min，8min)沉淀物3次，最后用无菌水洗涤3次；

步骤七，用无菌水重悬沉淀物，按V重悬液∶V正辛醇＝2：1的比例加入正辛醇。充分混匀后，4℃，2000g离心5min，分离混合相，并在4℃下储存24h。

步骤八，经过24h后，将液体弃去，留沉淀。然后重复步骤七，直至混合相中间没有细菌碎片。然后弃去液体，沉淀用无菌水换管清洗5次，用无菌水重悬。静置10分钟后吸取液体；

步骤九，纳米硒颗粒的制备：将在4℃静置24小时后的上下相弃去，留沉淀。然后分别用氯仿、75％乙醇清洗一次。然后用无菌水重悬沉淀，进行冷冻干燥48h以上，得到纳米硒颗粒；

步骤十，对纳米硒进行表征和Na

进一步，所述4株来自牦牛源、2株来自马源的益生菌包括：蜡样芽孢杆菌 A1、蜡样芽孢杆菌A2、蜡样芽孢杆菌A3、枯草芽孢杆菌E1、枯草芽孢杆菌4.3、枯草芽孢杆菌9.3。

进一步，步骤一中，所述纯化包括：将已有的6株菌在LB肉汤中常规培养，然后在LB琼脂平板上划线培养，挑取单菌落，重复液体发酵、琼脂平板划线， 3次后提取细菌DNA进行测序鉴定。

进一步，所述接种包括：蜡样芽孢杆菌A3按1％接种量接种于亚硒酸钠浓度为20mmol/L的LB肉汤

进一步，步骤一中，所述常规培养包括：37℃、180r/min的摇床中常规培养 120h。

进一步，所述筛选亚硒酸钠还原率高、发酵液红色物质生成量多的益生菌包括：

根据细菌发酵液的颜色，试管底部的红色沉淀多少，以及DAB法测量：准备含1g/LSe的亚硒酸钠标准液(含有48％溴化氢)，将标准液用超纯水稀释成 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20mg/L的溶液，体积均为1ml，然后再加超纯水至4ml。用现配的1：1浓盐酸将pH调至2～3，再加入400μL 0.2M 的EATA-2Na溶液和200μL 0.5％DAB溶液。将样品混匀后放入60℃温箱内 20min，而后用10％NaOH溶液将pH调至7～7.5。在试管内准确加入1ml甲苯，剧烈摇晃混匀。在3000r/min离心5min，吸取有机层于420nm处测量吸光度，以吸光度为y轴，硒浓度为x轴绘制标准曲线。将培养好的菌液在13000r/min 离心10min后，吸取上层澄清发酵液10μL，100倍稀释至1ml后补足超纯水至 4ml，然后按上述标曲测定步骤进行。用此标准曲线可以测算出培养液内剩余亚硒酸钠的含量，从而计算出菌株对于亚硒酸钠的还原率。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方法制备的用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒。

本发明的另一目的在于提供一种所述用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒作为用于抑制心肌肥大的药物的应用。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明利用牦牛源益生菌制备纳米硒不仅制备过程更加环保，同时还原制备的纳米硒有蛋白包被，稳定性更好，且制备纳米硒的亚硒酸钠所用浓度比较高。

附图说明

图1是本发明实施例提供的用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方法及药物，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方法采用牦牛源的益生菌利用微生物还原法进行纳米硒的制备。

如图1所示，本发明实施例提供的用于抑制心肌肥大的生物源纳米硒的制备方法包括以下步骤：

S101，选择6株来自牦牛源、马源的益生菌，并对选择的6株益生菌进行纯化；将纯化后的益生菌按1％的接种量接种至含有3、6、12、18、24、30mmol/L 硒元素的LB肉汤培养基中常规培养；

S102，根据细菌发酵液的颜色，试管底部的红色沉淀多少，以及DAB法测量得到的亚硒酸钠还原率筛选出最佳菌株；

S103，将筛选的菌株在含3、6、12、18、24、30mmol/L亚硒酸钠的LB琼脂平板上划线培养，挑取红色单菌落，重复3次液体发酵、琼脂平板划线，验证菌株；

S104，将选出的菌株按1％的比例接种至含有18、20、22.5、24mmol/L亚硒酸钠的LB肉汤中进行浓度筛选。选出最适浓度后，将菌株按1％的比例接种至含有最适浓度亚硒酸钠的LB肉汤中培养12、24、48、72、96、120h进行时间筛选；

S105，将筛选出的菌株在LB肉汤中摇床培养至OD600为0.7时按1％的比例接种至含亚硒酸钠最佳浓度的LB肉汤中，在37℃，180r/min的条件下培养最适时间；

S106，将培养好的菌液在4℃，13000r/min离心10min，弃去上清。将沉淀用0.9％NaCl清洗三次，每次在12000r/min离心8min。清洗后将沉淀置于无菌研钵中，加入液氮研磨。研磨后用少量无菌水重悬，然后在在冰浴、功率为100 W的条件下超声处理10min，在4℃、12000r/min离心10min并收集沉淀物。用含1％SDS的1.5mol/LTris-HCl(pH 8.3)离心洗涤(4℃，12000r/min，8min)沉淀物3次，最后用无菌水洗涤3次；

S107，用无菌水重悬沉淀物，按V重悬液∶V正辛醇＝2：1的比例加入正辛醇。充分混匀后，4℃，2000g离心5min，分离混合相，并在4℃下储存24h。

S108，经过24h后，将液体弃去，留沉淀。然后重复步骤S107，直至混合相中间没有细菌碎片。然后弃去液体，沉淀用无菌水换管清洗5次，用无菌水重悬。静置10分钟后吸取液体；

S109，纳米硒颗粒的制备：将在4℃静置24小时后的上下相弃去，留沉淀。然后分别用氯仿、75％乙醇清洗一次。然后用无菌水重悬沉淀，进行冷冻干燥 48h，得到纳米硒颗粒；

S110，对纳米硒进行表征和Na

本发明实施例提供的4株来自牦牛源、2株来自马源的益生菌包括：蜡样芽孢杆菌A1、蜡样芽孢杆菌A2、蜡样芽孢杆菌A3、枯草芽孢杆菌E1、枯草芽孢杆菌4.3、枯草芽孢杆菌9.3。

本发明实施例提供的接种包括：蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌在OD600值为0.7时按1％接种量接种于亚硒酸钠浓度为3、6、12、18、24、30mmol/L的 LB肉汤。

本发明实施例提供的筛选亚硒酸钠还原率高、发酵液红色物质生成量多的益生菌包括：

根据细菌发酵液的颜色，试管底部的红色沉淀多少，以及DAB法测量的亚硒酸钠还原率。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1：

中国典型培养物保藏中心；地址：中国.武汉.武汉大学；邮编：430072；电话：(027)68754052；传真：(027)68754833；E-mail：

该培养物已于2022年01月11日由本保藏中心收到，并登记入册，根据您 (们)的请求，由该日起保存三十年，在期满前收到提供培养物样品的请求后再延续保存五年。

该培养物的存活性本保藏中心于2022年01月18日检测完毕，结果为存活。

本发明选用蜡样芽孢杆菌A3(保藏号：CCTCC M2022060)，先纯化三次，将纯化后的细菌按1％的接种率接种至含有3、6、12、18、24、30mmol/L硒元素(亚硒酸钠)的LB肉汤中，180r/min，37℃的摇床中培养120h，而后根据细菌发酵液的颜色，试管底部的红色沉淀多少，以及DAB法测出的亚硒酸钠还原率来确定浓度筛选范围，将蜡样芽孢杆菌A3在含3、6、12、18、24、30mmol/L 亚硒酸钠的琼脂平板上划线培养，挑取红色单菌落，重复3次液体发酵、琼脂平板划线，进行验证；继而将其按1％的接种率接种至含有18、20、22.5、24mmol/L硒元素(亚硒酸钠)的培养液中，常规培养120h，而后根据细菌发酵液的颜色，试管底部的红色沉淀多少，以及DAB法测出的亚硒酸钠还原率来选择出最优硒元素添加量。然后将筛选的蜡样芽孢杆菌A3在含最佳亚硒酸钠浓度的LB肉汤中进行培养时间的筛选，确定最优培养时间，之后提取纳米硒球，并进行一系列理化鉴定。纳米硒制备方法为：将培养好的菌液在4℃，13000r/min离心10min，弃去上清。将沉淀用0.9％NaCl清洗三次，每次在12000r/min离心8min。清洗后将沉淀置于无菌研钵中，加入液氮研磨。研磨后用少量无菌水重悬，然后在在冰浴、功率为100W的条件下超声处理10min，在4℃、12000r/min离心10min 并收集沉淀物。用含1％SDS的1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.3)离心洗涤(4℃， 12000r/min，8min)沉淀物3次，最后用无菌水洗涤3次；用无菌水重悬沉淀物，按V重悬液∶V正辛醇＝2：1的比例加入正辛醇。充分混匀后，4℃，2000g离心5min，分离混合相，并在4℃下储存24h。经过24h后，将液体弃去，留沉淀。然后重复上一步骤，直至混合相中间没有细菌碎片。然后弃去液体，沉淀用无菌水换管清洗5次，用无菌水重悬。静置10分钟后吸取液体。纳米硒颗粒的制备：将在4℃静置24小时后的上下相弃去，留沉淀。然后分别用氯仿、75％乙醇清洗一次。然后用无菌水重悬沉淀，进行冷冻干燥48h以上，得到纳米硒颗粒。对纳米硒进行表征和Na

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。