非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料及其制备方法和应用

摘要

本发明公开一种非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料及其制备方法和应用。所述非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料包括钼酸钴‑磷钼酸复合纳米片和表面修饰所述复合纳米片的生物相容性聚合物；钼酸钴和磷钼酸的质量比为1：2‑1：4；所述钼酸钴‑磷钼酸复合纳米片和生物相容性聚合物的质量比为1：5‑1：15。所述非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料能够和过氧化氢反应产生同样活性的·OH，且同时能减少肿瘤环境中的GSH抗氧化剂来达到有效的脂质过氧化物累积。

说明书

技术领域

本发明属于生物纳米材料技术领域，具体涉及一种非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料及其制备方法和应用。

背景技术

细胞死亡方式主要包括凋亡和非凋亡。肿瘤自身的抗凋亡能力及肿瘤生长需要更多的铁累积和脂质代谢，故作为非凋亡细胞死亡方式的铁死亡受到更多关注。致癌信号会刺激氧化活性相关的酶使得活性氧物种(ROS)增加，通常也伴随着具有抗氧化能力的谷胱甘肽(GSH)的代谢来消除高表达的活性氧。利用肿瘤微环境中丰富的过氧化氢，Fe

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料及其制备方法和应用，所述非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料能够和过氧化氢反应产生同样活性的·OH，且同时能减少肿瘤环境中的GSH抗氧化剂来达到有效的脂质过氧化物累积。

第一方面，本发明提供一种非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料。所述非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料包括钼酸钴-磷钼酸复合纳米片和表面修饰所述复合纳米片的生物相容性聚合物；钼酸钴和磷钼酸的质量比为1：2-1：4；所述钼酸钴-磷钼酸复合纳米片和生物相容性聚合物的质量比为1：5-1：15。通过将上述质量比控制在该范围内，能够保证该材料的生物相容性以及谷胱甘肽消耗协同活性氧物种性能。

较佳地，所述生物相容性聚合物包括聚醚F127、大豆磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的至少一种，优选为聚醚F127。

较佳地，所述钼酸钴-磷钼酸复合纳米片是在纳米片中均匀分散且相互交织的复合物。

较佳地，所述非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料同时具有谷胱甘肽消耗能力和活性氧产生能力；优选地，非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料与肿瘤内过表达的谷胱甘肽发生氧化还原反应消除谷胱甘肽，并在其与谷胱甘肽的氧化还原反应过程中增加活性氧的产生。

较佳地，非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料与谷胱甘肽发生氧化还原反应后的产物与过氧化氢进一步反应通过罗素机制产生单线态氧

第二方面，本发明提供上述任一项所述的非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料的制备方法。所述制备方法包括：将钼源、钴源和有机溶剂混合得到混合溶液；将混合溶液转移至高压釜中进行反应，反应结束后离心洗涤，收集反应产物；将反应产物与生物相容性聚合物分散混合，得到所述非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料。

较佳地，所述钼源为含钼的多金属氧酸盐，钼源的浓度为0.01-0.02mM；所述钴源为钴盐，钴源的浓度为0.06-0.07mM；所述有机溶剂为丙酮、乙醇胺和油胺的混合物，优选地，丙酮、乙醇胺和油胺的体积比为(1–4)：(1–4)：(1–4)。

较佳地，反应温度为160-200℃，反应时间为3-12h。

较佳地，将反应产物与生物相容性聚合物在有机溶剂中分散混合并随后去除有机溶剂；所述有机溶剂包括二氯甲烷、乙醇、三氯甲烷、环己烷中的至少一种。

第三方面，本发明提供上述任一项所述的非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料作为铁死亡诱导剂的生物应用。

附图说明

图1是钼酸钴-磷钼酸复合纳米片(CPMNSs)的透射电子显微图；

图2是钼酸钴-磷钼酸复合纳米片的扫描电子显微图；

图3是钼酸钴-磷钼酸复合纳米片的Mo、P、Co、O能谱元素分析谱图；各图中的标尺长度以及标尺单位保持一致，标尺单位均为2.5μm；

图4是钼酸钴-磷钼酸复合纳米片的X射线衍射(XRD)谱图；

图5中的(a)是钼酸钴-磷钼酸复合纳米片的电子顺磁共振光谱检测羟基自由基的示意图，(b)是5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸(DTNB)指示剂检测的CPMNSs和GSH反应体系中GSH含量，该含量由吸光度进行表征；(c)是活性氧引起的亚甲基蓝(MB)降解的紫外吸收光谱，各曲线由上至下依次代表仅MB、2mM GSH、0mM GSH、0.5mM GSH、1mM GSH；(d)是有GSH条件下和无GSH条件下钴离子不同时间点的累积释放量；

图6中的(a)是GSH还原后Mo价态变化的X射线光电子(XPS)能谱，(b)是ESR光谱检测还原后的CPMNSs(ReCPMNSs)与过氧化氢反应单线态氧的产生示意图；

图7中的(a)是铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)对CPMNSs引起的小鼠乳腺癌(4T1)细胞存活率的影响，(b)是铁死亡抑制剂Liproxstatin-1(Lip-1)对CPMNSs引起的小鼠乳腺癌(4T1)细胞存活率的影响；(c)是CPMNSs培育不同浓度后的细胞内GSH含量测定，(d)是CPMNSs培育不同时间后的细胞内GSH含量测定；

图8中的(a)是CPMNSs培育不同浓度后的细胞内GPX4活性测定，(b)是CPMNSs培育不同时间后的细胞内GPX4活性测定，(c)是CPMNSs培育不同浓度后细胞内丙二醛(MDA)含量测定，(d)是CPMNSs培育不同时间后细胞内丙二醛(MDA)含量测定；

图9是Control、CPMNSs i.v.、CPMNSs i.t.和CPMNSs i.t.+DFOM四种治疗组的肿瘤体积随时间变化曲线；Control组不进行任何处理；CPMNSs i.v.组在第0和第7天尾静脉(i.v.)注射10mg/kg CPMNSs；CPMNSs i.t.组在第0和第7天尾瘤内(i.t.)注射10mg/kgCPMNSs；CPMNSs i.t.+DFOM组在CPMNSs i.t.组的基础上第0、4、8、12天腹腔注射20mg/kg铁死亡抑制剂去铁胺甲磺酸盐(DFOM)；

图10是Control、CPMNSs i.v.、CPMNSs i.t.和CPMNSs i.t.+DFOM四种治疗组的肿瘤内活性氧(ROS)和脂质过氧化水平(LPO)检测；各图中的标尺长度以及标尺单位保持一致，标尺单位均为200μm；

图11是Control、CPMNSs i.v.、CPMNSs i.t.和CPMNSs i.t.+DFOM四种治疗组的肿瘤内GPX4免疫组化切片；各图的标尺单位保持一致，均为100μm；

图12是Control、CPMNSs i.v.、CPMNSs i.t.和CPMNSs i.t.+DFOM四种治疗组在治疗结束后，肿瘤苏木精-伊红染色(H&E)、脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)介导的缺口末端标记法(TUNEL)和Ki-67切片；各图的标尺单位保持一致，均为100μm；

图13是Control、CPMNSs i.v.、CPMNSs i.t.和CPMNSs i.t.+DFOM四种治疗组的实验小鼠生长曲线记录，即生长率随时间的变化曲线。

具体实施方式

通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。在没有特殊说明的情况下，各百分含量指质量百分含量。

本公开提供一种非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料。也可以称为肿瘤微环境响应的谷胱甘肽消耗和活性氧物种增强的钼酸钴(CoMoO

钼酸钴(CoMoO

在实验过程中还发现，钼与谷胱甘肽的还原过程中钼元素价态的改变使得材料化学结构变化导致该纳米片的降解，促进了钴源释放，增加了活性氧的产生。具体地，(磷钼酸多金属氧酸盐结构中的)六价钼被还原为五价，从而能够进一步和过氧化氢反应通过罗素机制产生另一种单线态氧(

在此还说明的是，钼酸钴和磷钼酸的双重GSH消耗和活性氧产生加剧了脂质过氧化的结果，与单一组分相比使铁死亡更有效发生。

以下还示例性说明本发明所述非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料的制备方法。

将钼源、钴源与有机溶剂混合。钼源为含钼的多金属氧酸盐，浓度为0.01-0.02mM，优选为0.016mM的磷钼酸。钴源为钴盐，浓度为0.6-0.7mM，优选为0.68mM的乙酸钴。乙酸钴和磷钼酸的特定化学组成有利于构成钼酸钴(CoMoO

将混合溶液转移至高压反应釜中密封进行反应。反应温度为160-200℃；反应时间为3-12h，优选为6-12h。反应结束后离心洗涤，目的是将产物表面残留的有机溶剂洗净。产物用乙醇和环己烷分别洗涤。洗涤次数可各为3-5次。

将所得产物与生物相容性聚合物在有机溶剂中混合。这样的作用是产物表面有效地被生物相容性聚合物包裹，保证了体系良好的生物相容性和稳定性。所述有机溶剂包括二氯甲烷、乙醇、三氯甲烷、环己烷中的至少一种。例如可为二氯甲烷。所述生物相容性聚合物包括但不限于聚醚F127、大豆磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)中的任意一种，优选为聚醚F127。随后旋转蒸发去除有机溶剂。旋转蒸发温度可为40-60℃，蒸发时间可为1-2h。

一些实施方式中，将旋蒸后的产物分散在生理缓冲溶液中。例如将产物分散在pH为7.4的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠的生理缓冲溶液中。

本发明所述非铁基谷胱甘肽消耗协同活性氧物种增强复合材料解决了肿瘤铁死亡治疗中脂质过氧化物积累不足的技术问题，以及提供了该同时具有GSH消耗和活性氧产生能力的钼酸钴(CoMoO

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1

CoMoO

将CPMNSs分散在乙醇中，滴在铜网上用TEM观察形貌，从图1和图2可以看出CPMNSs呈现不规则的纳米片形貌。该复合纳米片的厚度为3-4nm。

将CPMNSs分散在乙醇中，滴在硅片进行元素能谱分析。由图3可以看出CPMNSs纳米片中Mo、P、Co和O均匀分布。

将CPMNSs冷冻干燥以进行XRD测定。图4的XRD分析说明CoMoO

修饰CoMoO

CPMNSs的性能表征。生物相容性聚合物(例如聚醚F127)的修饰不会影响CPMNSs的性能评价。未作具体说明的情况下，在pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液中(模拟肿瘤微环境)进行性能测定。

取CPMNSs(100μg/mL)与4mM过氧化氢和10mM碳酸氢钠，反应10分钟，用5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)作为捕获剂捕捉产生的·OH并用ESR光谱检测。图5中的(a)可以观察到典型的1：2：2：1的信号峰存在，说明产生了·OH。且加入生理条件丰富的HCO

1mM GSH和CPMNSs(50μg/mL)反应3h后，用DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(0.5mM)检测GSH含量。图5中的(b)可以看出，与CPMNSs反应后，DTNB在412nm处的紫外特征吸收下降，说明GSH发生消耗。

与不同浓度GSH反应30min后，还原的ReCPMNSs与H

用5mg CPMNSs与15mL PBS(pH＝6.5，10mM)和GSH(10mM)反应，到达设定时间点后(10min、0.5h、1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、72h)，取1mL反应溶液。将得到的溶液用王水消化后通过电感耦合等离子体(ICP)检测Co离子的释放含量。由图5中的(d)可以看出GSH的加入能够加速Co离子的释放，使之能更有效地与H

将CPMNSs(100μg/mL)与GSH(1mM)氧化还原反应后的产物冷冻干燥后进行XPS分析。由图6中的(a)可以看出，GSH还原后，低结合能代表的低价态Mo峰出现，说明六价钼被还原为五价钼。

将还原后的ReCPMNSs(100μg/mL)与H

细胞内铁死亡评价

将4T1细胞接种于96孔板中，在含体积分数5％CO

从图7中的(a)和(b)可以看出，与Fer-1或Lip-1铁死亡抑制剂共孵育后，CPMNSs引起的细胞死亡被显著抑制。

将4T1细胞种于6孔板中培养24小时，然后用不同浓度CPMNSs(0、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL)孵育12h或者用同一浓度CPMNSs(150μg/mL)孵育不同时间(0、3h、6h、9h)后，4T1细胞用裂解液裂解，然后用总谷胱甘肽检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测GSH含量以及谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测GPX4活性。

由图7中的(c)和(d)，随浓度的增加或者培养时间的延长，GSH含量越来越少。由图8中的(a)-(b)可以看出，随浓度的增加或者培养时间的延长，GPX4活性也随之降低。相同细胞处理条件下脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量通过脂质氧化(MDA)检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测。由8中的(c)和(d)可以看出，细胞MDA含量随CPMNSs浓度的增加和孵育时间的延长而升高，说明了脂质过氧化的增强。

CPMNSs在体内铁死亡治疗效果评价

将4T1细胞种植到Balb/c裸鼠皮下，当肿瘤体积到达约100mm

由图9可以看出，与对照组相比，CPMNSs处理的小鼠对肿瘤有不同程度的抑制，且在引入铁死亡抑制剂DFOM后，CPMNSs对肿瘤生长的抑制效果明显减弱。

为观察CPMNSs在体内活性氧和脂质过氧化情况，小鼠瘤内或尾静脉注射CPMNSs(10mg/kg)12h后，瘤内注射100μL DCFH-DA染料(活性氧指示试剂，10μM)或者100μL C11-BODIPY

治疗结束后，获取肿瘤进行GPX4免疫组化、苏木精—伊红染色(H&E)、转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记(TUNEL)和Ki-67切片分析。与对照组相比，CPMNSs处理组中GPX4表达显著降低(图11)并且肿瘤组织受到损伤，出现凋亡，细胞增殖能力减弱(图12)。

为了进一步评价CPMNSs肿瘤治疗效果，记录小鼠生存曲线，每隔两天记录小鼠肿瘤体积，当肿瘤体积到达1500mm