一种用于治疗主动脉夹层和主动脉瘤的离子试剂及制备方法与应用

摘要

一种用于治疗主动脉夹层和主动脉瘤的离子试剂及制备方法与应用，使用本发明的离子试剂培养主动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞和骨髓来源的巨噬细胞时，能够抑制内皮细胞衰老、促进巨噬细胞向M2型极化和抑制平滑肌细胞凋亡。而且，通过静脉注射所述离子试剂，能够抑制血管衰老、抑制血管炎症和抑制血管凋亡，治疗主动脉夹层/主动脉瘤疾病，可为科学研究及临床治疗提供可行的方法和依据。此外，本发明的离子试剂来源广泛，安全有效，可以促进受损血管功能恢复，为关于主动脉夹层和主动脉瘤的科学实验研究和临床治疗提供了可行的方法和依据。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于治疗主动脉夹层和主动脉瘤的离子试剂及制备方法与应用。

背景技术

主动脉夹层/主动脉瘤是一类较为常见的血管类疾病，发病凶险，具有高致死率和致残率，严重威胁人类健康。主动脉夹层是指血管内膜撕裂，血流进入动脉壁层；主动脉瘤是指主动脉呈瘤样扩张，超过正常直径50％。高龄是主动脉夹层和主动脉瘤发生的主要危险因素，年龄大于65岁的男性发病率高达9％。近些年来，降血压药物如β- 受体阻断剂和血管紧张素转化酶抑制剂、降血脂的他汀类药物、抗生素等药物以及干细胞疗法被相继报道可能具有治疗主动脉夹层/主动脉瘤的效果，但临床治疗效果存在争议，所以目前主动脉夹层/主动脉瘤仍“无药可治”，外科手术治疗是目前最主要的治疗手段，但由于术后的高并发症和高死亡率，因此也极具危险性。因此，探索有效的能明显减缓或抑制主动脉夹层/主动脉瘤的发生、发展和破裂的新方法已成为亟待解决的难题，具有十分重要的研究意义。

研究表明，内皮细胞衰老、功能紊乱、巨噬细胞浸润/极化以及平滑肌细胞凋亡是主动脉夹层/主动脉瘤发生所共有的重要病理特征。内皮细胞已被证实在多种血管类疾病中起始动作用，其中一个主要的原因是衰老引起内膜损伤后，大量的炎性细胞浸润并释放炎性因子，导致血管中膜功能退化，引发血管功能障碍。内皮细胞结构和功能的完整性在保护血管免于形成主动脉夹层/主动脉瘤中具有重要作用，而由衰老引起的内皮细胞功能紊乱是主动脉夹层/主动脉瘤发生的重要危险因素。

并且，现有的针对心肌梗死的治疗方案，由于心肌梗死和主动脉瘤/主动脉夹层是两种完全不同的疾病。心肌梗死是指冠状动脉堵塞导致的心脏心肌细胞大量凋亡和坏死，是一种心脏疾病。而主动脉瘤 /主动脉夹层是由于主动脉(可能发生的部位包括：主动脉弓、升主动脉、降主动脉和腹主动脉)发生病变，是一种大血管疾病。且从发病机制上，心肌梗死是大量心肌细胞凋亡，而主动脉夹层是主动脉平滑肌细胞凋亡。治疗心肌梗死需要抑制心肌细胞凋亡，而治疗主动脉瘤/主动脉夹层则需要抑制主动脉平滑肌细胞凋亡，虽然都是细胞凋亡，但涉及的是不同细胞类型。现有的针对心肌梗死的治疗方案多采用血管新生的手段，而血管新生是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，是促进坏死心肌组织中的血管新生；而主动脉瘤/主动脉夹层是由高危因素引起的血管损伤，治疗主动脉瘤/主动脉夹层通过促进血管内皮细胞和平滑肌细胞修复等参与大血管损伤修复，治疗治疗主动脉瘤/主动脉夹层不涉及到促进血管新生的过程，因此，现有的针对心肌梗死的治疗方案无法应用于治疗主动脉瘤 /主动脉夹层。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷与不足，本发明提供了一种用于治疗主动脉夹层和主动脉瘤的离子试剂及制备方法与应用。

本发明采用的技术解决方案是：一种用于治疗主动脉夹层和主动脉瘤的离子试剂，所述的离子试剂包括具有生物相容性的液体和分散于所述液体中的生物活性离子，所述生物活性离子选自Si、Sr、Mg、 Zn、Cu、Mn、Fe、Se离子中的一种或几种。

所述的具有生物相容性的液体为生理盐水或DMEM细胞培养基。

所述的Sr、Mg、Zn、Cu、Mn、Fe离子为金属阳离子。

所述的Si离子和Se离子为酸根阴离子。

所述的Si离子包括偏硅酸根离子SiO

所述的Se离子包括亚硒酸根离子SeO

所述的离子试剂中总的Si离子的浓度可为0.98～90.62μgmL

一种用于治疗主动脉夹层和主动脉瘤的离子试剂的制备方法，通过以下步骤制备：将具有生物相容性的液体对含有所述生物活性离子的无机生物材料进行浸提，得到所述离子试剂，所述的生物活性离子选自Si、Sr、Mg、Zn、Cu、Mn、Fe、Se离子中的一种或几种。

所述的无机生物材料选自氯化锶、氯化镁、氯化锌、氯化铜、氯化锰、氯化铁、硅酸钠和亚硒酸钠等可溶性盐或含Si、Sr、Mg、Zn、Cu、Mn、Fe、Se的无机矿物以及金属氧化物中的至少一种，或其中任意两种以上的组合。

一种所述的离子试剂在制备用于主动脉夹层和主动脉瘤受损大血管修复药物上的应用。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种用于治疗主动脉夹层和主动脉瘤的离子试剂及制备方法与应用，使用本发明的离子试剂培养主动脉内皮细胞、主动脉平滑肌细胞和骨髓来源的巨噬细胞时，能够抑制内皮细胞衰老、促进巨噬细胞向M2型极化和抑制平滑肌细胞凋亡。而且，通过静脉注射所述离子试剂，能够抑制血管衰老、抑制血管炎症和抑制血管凋亡，治疗主动脉夹层/主动脉瘤疾病，可为科学研究及临床治疗提供可行的方法和依据。此外，本发明的离子试剂来源广泛，安全有效，可以促进受损血管功能恢复，为关于主动脉夹层和主动脉瘤的科学实验研究和临床治疗提供了可行的方法和依据。

附图说明

图1为含不同浓度Si离子浸提液对小鼠主动脉内皮细胞(MAECs) 活性的影响。

图2为含不同浓度Sr离子溶液对小鼠MAECs活性的影响。

图3为含不同浓度Mg离子溶液对小鼠MAECs活性的影响。

图4为含不同浓度Zn离子溶液对小鼠MAECs活性的影响。

图5为含不同浓度Cu离子溶液对小鼠MAECs活性的影响。

图6为含不同浓度Mn离子溶液对小鼠MAECs活性的影响。

图7为含不同浓度Fe离子溶液对小鼠MAECs活性的影响。

图8为含不同浓度Se离子溶液对小鼠MAECs活性的影响。

图9为Si离子DMEM浸提液稀释至1/8(4.53±0.18μgmL

图10为Si离子DMEM浸提液稀释至1/8(4.53±0.18μgmL

图11为Si离子DMEM浸提液稀释至1/8(4.53±0.18μgmL

图12为Si离子生理盐水浸提液原液(77.63±0.16μgmL

图13为Si离子生理盐水浸提液原液(77.63±0.16μgmL

具体实施方式

以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图和下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

在此提出“离子疗法”的概念，通过静脉注射活性离子(例如无机生物材料释放的活性离子)，调控血管相关内皮细胞衰老和平滑肌细胞凋亡以及免疫相关巨噬细胞极化，从而抑制血管衰老、抑制炎症、抑制凋亡和促进血管损伤修复。

本发明一实施方式提供一种能够治疗主动脉夹层/主动脉瘤的离子试剂。该离子试剂中含有生物活性离子，所述生物活性离子可选自 Si、Sr、Mg、Zn、Cu、Mn、Fe、Se离子中的至少一种。

该离子试剂还可含有具有生物相容性的液体，生物活性离子分散于所述具有生物相容性的液体中。

该离子试剂中，Si离子的存在形式是SiO

Sr、Mg、Zn、Cu、Mn、Fe、Se离子和Si离子类似具有调控血管相关细胞活力的作用，因此Sr、Mg、Zn、Cu、Mn、Fe、Se离子同样能够用于主动脉夹层/主动脉瘤的治疗。

所述生物活性离子可以是无机生物材料释放的生物活性离子。所述无机生物材料选自氯化锶、氯化镁、氯化锌、氯化铜、氯化锰、氯化铁、硅酸钠和亚硒酸钠等可溶性盐或含Si、Sr、Mg、Zn、Cu、Mn、 Fe、Se的无机矿物以及金属氧化物中的至少一种，或其中任意两种以上的混合。

一个示例中，所述离子试剂中含有Si离子，其中Si离子的浓度可为0.98～90.62μgmL

另外，所述离子试剂中，Sr离子的浓度可为3.63～456.84μgmL

所述离子试剂中，Mg离子的浓度可为3.63～464.6μgmL

所述离子试剂中，Zn离子的浓度可为0.3～17.5μgmL

所述离子试剂中，Cu离子的浓度可为0.04～4.77μgmL

所述离子试剂中，Mn离子的浓度可为0.01～1.48ngmL

所述离子试剂中，Fe离子的浓度可为0.14～18.36μgmL

所述离子试剂中，Se离子的浓度可为0.002～0.34μgmL

所述具有生物相容性液体优选为液态细胞培养基、或者能够注射到生物体内的液体。例如优选为生理盐水(Saline，可购自商用，例如购自四川科伦药业股份有限公司，国药准字：H51021158)或细胞培养基(DMEM，可为本领域公知的高糖DMEM，购置Gibco，型号为11965-092)。选用生理盐水溶液时，可以维持和人体相近的渗透压。选用细胞培养基时，可以为细胞生长提供必要的营养物质。

在可选的实施方式中，所述离子试剂是含有无机生物材料释放的生物活性离子的浸提液或由无机盐类配置的离子液体。

所述无机生物材料选自氯化锶、氯化镁、氯化锌、氯化铜、氯化锰、氯化铁、硅酸钠和亚硒酸钠等可溶性盐或含Si、Sr、Mg、Zn、 Cu、Mn、Fe、Se的无机矿物以及金属氧化物中的至少一种。所述生物材料可购自商用或自行制备。其制备方法不限，例如，可以采用共沉淀或溶胶凝胶法制备。

本发明一实施方式中，以具有生物相容性的液体为提取试剂，对含有所述生物活性离子的无机生物材料进行浸提，制备离子试剂。即，所述离子试剂可以是具有生物相容性的液体或无机生物材料的浸提液。

制备含有Si离子浸提液时，可以对生物矿石CaSiO

制备含其它离子的浸提液时，亦可对含有该离子的无机生物材料/无机盐类进行浸提/配置成相应浓度的离子，在此不再赘述。

一个示例中，含不同浓度Si离子的浸提液制备方法为：按照ISO 10993-5标准制备粉体浸提液，所用提取溶剂为DMEM或生理盐水，纯的生物矿石CaSiO

另一个示例中，含不同浓度Cu离子的浸提液制备方法为：购买商用氯化铜试剂，麦克林，货号：1317-38-0。所用提取溶剂为水，配置成1000倍的母液，最后将浸提原液通过DMEM梯度配比稀释。

在不影响本发明的目的的情况下，所述离子试剂中还可以含有其它组分。

在此公开的离子试剂可用于“离子疗法”，即，将该离子试剂注入人或动物中，可以促进大血管的修复，治疗主动脉夹层/主动脉瘤。注射方式可为静脉注射等。

以下，说明获得离子试剂的最优作用浓度的步骤以及“离子疗法”对主动脉夹层/主动脉瘤的治疗效果。

在此，通过含不同浓度生物活性离子(例如Si离子)浸提液培养细胞的方法，探索生物活性离子促进内皮细胞衰老的效果，发现离子试剂在此浓度下能直接抑制内皮细胞衰老、促进巨噬细胞向M2型极化和抑制平滑肌细胞凋亡，从而修复受损血管。该离子试剂及“离子疗法”具有制备工艺简单易行、成本低廉、且便于推广等优点。

一个实施方式中，获得Si离子试剂抑制内皮细胞衰老、促进巨噬细胞极化、抑制平滑肌细胞凋亡的作用浓度，具体包括以下步骤。其它离子试剂亦可采用该步骤。

(1)含不同浓度的Si离子浸提液的制备。

(2)将步骤(1)中获得的含Si离子浸提液培养MAECs，采用 CCK8法检测细胞活力，筛选促进MAECs活力保持的Si浓度范围以及最优浓度。

(3)将步骤(2)中获得的促进MAECs活力保持的最优离子试剂培养MAECs、MBMMs和MASMCs，采用SA-β-Gal染色、免疫印迹和免疫荧光等方法检测MAECs细胞衰老的情况。采用流式细胞术、酶联免疫吸附法和免疫印迹等方法检测MBMMs极化情况以及 MASMCs凋亡情况。进一步的采用动物实验，将离子试剂静脉注射后，检测离子试剂对于小鼠主动脉夹层/主动脉瘤的治疗影响。

本发明利用具有生物相容性的液体(如生理盐水或DMEM)与生物活性离子(例如Si离子)复配，得到了用于治疗主动脉夹层/主动脉瘤的离子试剂，最终实现了主动脉夹层/主动脉瘤的血管修复目的。该方法经过反复实验验证，效果极佳。

本发明的有益效果：

(1)制备工艺简单易行；(2)成本低廉且便于推广；(3)提出了用于主动脉夹层/主动脉瘤干预治疗的“离子疗法”的新概念；(4) 治疗方法易操作且无二次伤害。

本发明为主动脉夹层/主动脉瘤的治疗提供了新的可行方法，“离子疗法”可以用于主动脉夹层/主动脉瘤的临床治疗等。

下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制。本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体工艺参数等也是适合范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业和科学用于与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

以下实例中，生物矿石CaSiO

实施例1：

(1)Si离子试剂的制备

按照ISO 10993-5标准制备CaSiO

表1梯度稀释Si浸提液中的Si离子浓度(μgmL

(2)铜离子试剂的制备

将氯化铜溶液配置成1000倍的母液，即504.5mg氯化铜粉末溶于50mL去离子水中。再将母液按照1:1000的比例稀释至DMEM培养基中，即铜离子浓度为10.9μgmL

实施例2：

(1)硅离子试剂对MAECs活力的影响

以1.5X10

图1显示(a)Si离子DMEM浸提液稀释至1～1/128之间，对照表1，Si离子浓度在5.82～46.88μgmL

(2)锶离子试剂对MAECs活力的影响

以1.5X10

图2显示(a)Sr离子DMEM浸提液稀释至1～1/128之间，即 Sr离子浓度在3.63～456.84μgmL

(3)镁离子试剂对MAECs活力的影响

以1.5X10

图3显示(a)Mg离子DMEM浸提液稀释至1～1/128之间，即 Mg离子浓度在3.63～464.6μgmL

(4)锌离子试剂对MAECs活力的影响

以1.5X10

图4显示(a)Zn离子DMEM浸提液稀释至1/2～1/128之间，即 Zn离子浓度在0.3～17.5μgmL

(5)铜离子试剂对MAECs活力的影响

以1.5X10

图5显示(a)Cu离子DMEM浸提液稀释至1～1/128之间，即 Cu离子浓度在0.04～4.77μgmL

(6)锰离子试剂对MAECs活力的影响

以1.5X10

图6显示(a)Mn离子DMEM浸提液稀释至1～1/128之间，即 Mn离子浓度在0.01～1.48μgmL

(7)铁离子试剂对MAECs活力的影响

以1.5X10

图7显示(a)Fe离子DMEM浸提液稀释至1～1/128之间，即 Fe离子浓度在0.14～18.36μgmL

(8)硒离子试剂对MAECs活力的影响

以1.5X10

图8显示(a)Se离子DMEM浸提液稀释至1～1/128之间，即 Fe离子浓度在0.002～0.34μgmL

(9)Si离子试剂对MAECs衰老的影响

以1.5X10

图9显示，Si离子在此浓度能够抑制MAECs衰老。(a)通过 SA-β-Gal染色实验发现，Si离子处理三天可以有效抑制MAECs中 SA-β-Gal阳性细胞的比例和上调SIRT1的蛋白表达；(b，c)通过免疫印迹实验发现，Si离子处理三天提高SIRT1蛋白表达和抑制γH2A.X的蛋白表达，同时增加γH2A.X在细胞核中的表达；(d)通过免疫荧光实验发现，Si离子处理三天抑制γH2A.X在MAECs细胞核中的表达。进一步说明了Si离子浸提液在此浓度能够通过抑制主动脉内皮细胞衰老，从而保护内皮细胞功能紊乱，启动血管自我修复机制。

实施例3：

Si离子试剂对巨噬细胞极化的影响

以4.5X10

图10结果显示Si离子在此浓度能够促进MBMMs向M2型极化。 (a)通过流式细胞实验发现，Si离子处理三天能够增加CD206

实施例4：

Si离子对平滑肌细胞凋亡的影响

以1.5X10

图11结果显示Si离子在此浓度能够抑制MASMCs凋亡。(a) 通过流式细胞实验发现，Si离子处理三天能够抑制MASMCs中 AnnexinV-FITC

实施例5，

“Si离子疗法”对主动脉夹层/主动脉瘤的治疗作用

(1)“Si离子疗法”对Ang II诱导的小鼠的生存率、主动脉瘤发生率、腹主动脉直径、胶原沉积的影响

主动脉动脉瘤小鼠模型通过Ang II灌注28天后诱导。采用静脉注射的方式将Si离子生理盐水浸提液(原液，离子浓度见表2)以 100μL/次的量注入小鼠体内，隔天注射一次，一共注射7次(图12， a)。记录整个实验过程中小鼠的死亡率和主动脉主动脉瘤的发生率，4周后采用腹主动脉超声考察腹主动脉直径。处死小鼠，并对腹主动脉进行冰冻切片，采用Masson考察腹主动脉胶原沉积的影响。

图12显示出实施例1所得的Si离子试剂注射7次对主动脉瘤治疗的动物实验结果。如图所示，Si离子试剂注射7次对Ang II诱导后的主动脉瘤有修复作用，包括轻微抑制了小鼠的死亡率，减缓了主动脉瘤的严重程度，抑制了血管扩张，抑制了胶原蛋白的沉积。表明Si离子对主动脉瘤有治疗作用，包括抑制血管扩张和胶原沉积，这种治疗作用是通过抑制血管衰老、炎症和凋亡实现的。

(1)“Si离子疗法”对β-BAPN诱导的小鼠生存率、主动脉瘤发生率、主动脉弓直径和胶原沉积的影响

主动脉夹层小鼠模型通过β-BAPN饲喂28天后诱导。采用静脉注射的方式将Si离子生理盐水浸提液(原液)以100μL/次的量注入小鼠体内，隔天注射一次，一共注射14次(图13，a)。记录整个实验过程中小鼠的死亡率和主动脉夹层的发生率，4周后采用主动脉弓超声考察主动脉弓直径。处死小鼠，并对主动脉弓进行冰冻切片，采用Masson染色考察腹主动脉胶原沉积的变化。

图13显示出实施例1所得的Si离子试剂注射14次对主动脉夹层治疗的动物实验结果。如图所示，Si离子试剂对β-BAPN诱导后的主动脉夹层有修复作用，抑制了小鼠的死亡率和主动脉夹层的发生率，降低了主动脉夹层的严重程度，抑制了血管扩张，抑制了胶原蛋白的沉积。表明Si离子对主动脉夹层有治疗作用，包括降低小鼠死亡率和主动脉夹层发生率，抑制血管扩张和胶原沉积

两种小鼠模型均表明Si离子有治疗主动脉夹层/主动脉瘤的作用

因此，本发明首次阐述和证实了Si离子对主动脉夹层/主动脉瘤具有很好的疗效，提示含Si的离子在主动脉夹层/主动脉瘤中具有良好的应用前景，为其治疗提供新的选择和药物研发思路。

各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。