一种魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因敲除突变株及其应用

摘要

本发明公开了一种魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因敲除突变株及其应用，属于基因工程领域。本发明首次提出魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)yqjH基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并提出将魏氏柠檬酸杆菌的yqjH基因敲除而获得基因敲除突变株ΔyqjH，并保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为：GDMCCNo：62255，菌体的生物被膜形成能力得到提高。本发明还提供了突变株的培养条件，使突变株形成生物被膜的能力比野生型菌株最高提高了4.20倍，可应用于生物被膜工程领域，从而拓宽了魏氏柠檬酸杆菌用于环境重金属离子污染治理和构建生物被膜蛋白合成工厂等的应用场景和范围。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因敲除突变株及其应用。

背景技术

柠檬酸杆菌属的细菌是革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧，代谢方式有呼吸和发酵两种类型，是人及动物的正常肠道栖居菌群，柠檬酸杆菌在自然环境分布极广，如土壤、水、污水和食物中，本实验室从工业腐败产品中分离到的魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacterwerkmanii)，是柠檬酸杆菌属的细菌，贮藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 1.1242，该菌株兼性厌氧，具有一定的生物膜形成能力，但其形成的生物膜产量易受外界营养和环境条件的制约。

细菌生物被膜(BF)，是粘附于物品表面的细菌，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包裹而成的大量细菌聚集成庞大网络膜状物。细菌生物被膜是细菌为适应自然环境有利于生存的一种生命现象，由细菌及其分泌物积聚而成，其结构复杂，主要构成成分为：水、菌体、脂质、蛋白质、多糖、DNA、RNA等。激光共聚焦扫描显微镜技术观察BF独特的三维立体结构发现：细菌本身在生物被膜中仅占总体积的10％～20％，大部分是细菌分泌的粘性物质和胞外多糖。生物被膜的内部包含众多间隙和互通的通道，比表面积大，这赋予其强大的吸附能力和自我修复能力，细菌生物被膜这复杂特殊的结构，使得生物被膜内个体细菌比游离细菌的耐药性更强，被膜内的细菌不易被杀菌剂完全杀灭，一旦停用杀菌剂，耐药菌株迅速重新生成生物被膜，因此，除了细菌生物被膜具有一定的危害性以外，利用其比表面积，吸附力和生命力以及自我修复能力强的特点，可以对其进行开发利用，并已经成为在蛋白合成微工厂等领域应用的重要材料和载体。但上述应用必须以菌体能够形成足够多的生物被膜为基础，而如何提高生物被膜的形成量，一直是一个科研的难点和热点，另外，生物被膜的形成也受到外界营养和环境条件的影响和制约，寻找最佳的生物被膜形成条件，也应引起足够的重视。

yqjH基因与铁载体利用和铁调节相关，编码铁还原酶，可以催化铁螯合剂中三价铁还原为亚铁形式，从而铁载体释放铁到细胞质中，对维持铁在细胞中平衡有重要作用。该基因由yqhI控制转录。有报道称，枯草芽孢杆菌yqjH敲除后细菌对紫外照射敏感；鸭疫里默氏杆菌缺乏铁载体相互作用蛋白后其生物膜减少，毒力降低。目前没有魏氏柠檬酸杆菌中的yqjH基因的相关报道，其该基因在魏氏柠檬酸杆菌中可能具有重要的功能，可以使用基因工程等手段对其进行开发利用。

发明内容

本发明首次披露魏氏柠檬酸杆菌中的yqjH基因，并针对现有技术中魏氏柠檬酸杆菌在特定条件下生物被膜形成能力有限的不足，提供一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法，具体是采取基因工程手段，对细菌如魏氏柠檬杆菌中的部分基因如yqjH进行改造和干预，研究发现可以提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜的形成量，从而提高其在环境治理和蛋白合成微工厂等方面的应用潜力。

本发明的第一个目的在于提供魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)中的yqjH基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因全长774bp，编码的蛋白有257个氨基酸序列。

本发明的第二个目的在于提供一种魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)yqjH基因敲除突变株，是将魏氏柠檬酸杆菌的yqjH基因敲除而获得，所述的yqjH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述的突变株为魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)ΔyqjH，其保藏号为：GDMCC No：62255。

优选地，所述的突变株是以GDFMZ BF-8为出发菌株，所述GDFMZ BF-8的保藏号为GDMCC No:61858。

本发明的第三个目的在于提供上述yqjH基因和/或突变株在提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成中的应用。

优选地，所述突变株的产生物被膜条件是：于25℃～37℃，在LB、TSB或NB培养基中培养。

更优选地，所述突变株的产生物被膜条件为：

于25℃～37℃，在NB培养基中静置培养；

或于25℃～30℃，在LB培养基中静置培养，37℃振荡培养；

或于25℃～30℃，在TSB培养基中静置培养，37℃振荡培养。

最优选地，所述突变株的产生物被膜条件为：于30℃，在NB培养基中静置培养。

本发明的第四个目的是提供一种增加魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成量的方法，将魏氏柠檬酸杆菌野生菌株中的yqjH基因敲除，所述的yqjH基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在一优选例中，所述方法包括以下步骤：

(1)以提取的魏氏柠檬酸杆菌野生株基因组DNA作为模板，分别以yqjH-up-F和yqjH-up-R，yqjH-down-F和yqjH-down-R为引物，扩增得到yqjH基因的上下游同源序列；

所述的引物yqjH-up-F的序列如SEQ ID NO.4所示，

所述的引物yqjH-up-R的序列如SEQ ID NO.5所示，

所述的引物yqjH-down-F的序列如SEQ ID NO.6所示，

所述的引物yqjH-down-R的序列如SEQ ID NO.7所示；

(2)用BglII单酶切pYG4质粒(其序列如SEQ ID NO.10所示)，并割胶回收；

(3)扩增得到的yqjH基因的上下游同源片段，连接到酶切后的质粒pYG4上，构建敲除载体pYG4-yqjH，然后热激转化大肠杆菌S17-1；

(4)将携带有敲除载体pYG4-yqjH的大肠杆菌S17-1与魏氏柠檬酸杆菌野生菌株共孵育，将共孵育物用敲除鉴定引物yqjH-QJ-F和yqjH-QJ-R鉴定yqjH基因一次交换重组子；

所述的引物yqjH-QJ-F的序列如SEQ ID NO.8所示，

所述的引物yqjH-QJ-R的序列如SEQ ID NO.9所示；

(5)然后将一次交换重组子扩大培养，使用敲除鉴定引物yqjH-QJ-F和yqjH-QJ-R鉴定成功敲除魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因的工程菌ΔyqjH。

优选地，魏氏柠檬酸杆菌野生株为GDFMZ BF-8，其保藏号为GDMCC No:61858。

优选地，所述的扩增得到yqjH基因的上下游同源序列连接到酶切后的质粒pYG4上，使用的是一步无缝连接法。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)本发明首次发现并提供魏氏柠檬酸杆菌中的yqjH基因核苷酸序列，为后续对其进行开发利用奠定了基础；

(2)本发明采取基因工程手段，对细菌如魏氏柠檬杆菌中的部分基因如yqjH进行改造和干预，发现可以提高菌体的性能，如使其具备更好的生物被膜形成能力和对杀菌剂的抗药性；

(3)本发明提供有利于魏氏柠檬酸杆菌生物膜形成的关键环节，包括培养时间、粗糙黏附材料的使用、培养温度、动静态培养、营养丰富的培养基，用本发明所述的突变株进行生物被膜形成量的测定，发现该突变株生物被膜形成能力最高比该基因敲除的出发菌株提高了4.20倍，可应用于生物被膜工程领域，从而拓宽了魏氏柠檬酸杆菌用于环境重金属离子污染治理和构建生物被膜蛋白合成工厂等的应用场景和范围。

保藏说明

1、Citrobacterwerkmanii GDFMZ BF-8，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址是：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59栋5楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCC No：61858，保藏日期：2021年8月10日。

2、Citrobacter werkmaniiΔyqjH，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址是：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59栋5楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCC No：62255，保藏日期：2022年2月18日。

附图说明

图1是魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因敲除菌株ΔyqjH的PCR鉴定图(泳道1：DL5000 DNAMarker，购买自：北京擎科新业生物技术有限公司；泳道2：yqjH上游片段；泳道3：yqjH下游片段；泳道4：敲除鉴定片段)。

图2是魏氏柠檬酸杆菌野生菌株和yqjH基因敲除菌株ΔyqjH在不同温度和不同培养基上的生物被膜形成量。A：25℃、静置培养；B：30℃、静置培养；C：37℃、静置培养；D：25℃、120rpm振荡培养；E：30℃、120rpm振荡培养；F：37℃、120rpm振荡培养。注：柱子上方的数字为均值。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

以下实施例中使用的野生魏氏柠檬酸杆菌是魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8。

实施例1魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因敲除突变株的构建

一、yqjH敲除载体的构建

首先，将魏氏柠檬酸杆菌的yqjH基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

ATGACAAAAAACACCTCACGCTACCCTCAGCGCGTTCGCAATGAACTGCGCTTCCGTGAACTTACTGTCCTGCGCGTAGAACGTATTAGCGCGGGTTTTCAGCGCATCGTACTGGGCGGTGACGCGCTGGACGGTTTTAGCTCGCACGGTTTTGATGACCATACCAAGGTCTTTTTCCCGGAGCCGGGCAGCCATTTTGTGCCGCCTGTTGTCACCGATGAAGGCATTGTCTGGGCTGACGGCGTACGTCCGCTCTCCCGTGACTACACGCCGTTGTATGACGAAGCGCGCCATGAGCTGGCACTGGATTTTTATATTCATGACGGTGGCGTGGCGAGCACATGGGCGATGAATGCTCGCGAGGGTGACAAGCTGACGATCGGTGGTCCGCGCGGTTCTTTGGTGGTGCCAGAGGATTATGCGTATCAGGTTTACGTGTGTGATGAATCAGGAATGCCCGCGCTGCGCCGACGGCTGGAGTCGCTCAGCCGTTTAGCGGTACGCCCGAACGTAACGGCGCTGGTAAACGTGCAGGATGCGGCGTATCAGGACTATTTTGCCCATCTCGACGAGTTTACTATTCAGTGGTTTATCGGCCATGACGAACAGGTGGTGAACGAACATTTATCGCGGCTGAACGTGCCCGCAGACGATTATTTCATCTGGATTACCGGCGAAGGCAAGGCGGTAAAAAACCTCAGCGTTCGCTTTGAAACCGAGGCGTTCGATCAGCAACTGGTGCGCGCAACGGCTTACTGGCATCAACGCCGTTAA，共774bp)的上游同源序列(1155bp；其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示)和下游序列(831bp；其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，以及pYG4质粒序列(5796bp；其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)，拷贝到软件CE Design V1.04的多片段克隆(ClonExpress MultiS)的相关位置，并进行相关设置：载体线性化方式选择单酶切线性化，插入片段个数选择2，请选择线性化酶切位点选择BglII。用软件CE Design V1.04设计输出的yqjH-up-F/yqjH-up-R和yqjH-down-F/yqjH-down-R引物对，委托北京擎科新业生物技术有限公司广州分公司进行引物合成。以野生魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8的基因组作为模板，使用yqjH-up-F/yqjH-up-R和yqjH-down-F/yqjH-down-R引物对和高保真扩增酶

所述的引物序列如下：

yqjH-up-F：aaaagtgccacctgcagatctATCGCCCAAATCAGCCACT(SEQ ID NO.4)，

yqjH-up-R：gccgccatcgaattactgaTTTTTCGCCTTCGTGAAGATAAT(SEQ ID NO.5)，

yqjH-down-F：aTCAGTAATTCGATGGCGGCA(SEQ ID NO.6)，

yqjH-down-R：agtcatatgccgcggagatctCTATCGAATAGCGGACACATCACC(SEQ IDNO.7)；

其中yqjH-up-F和yqjH-down-R其5’端都分别含有载体pYG4上的部分序列片段；yqjH-up-R的5’端含有下游同源片段前部部分序列；yqjH-down-F的5’端含有上游同源片段的后部部分序列。

其混合体系如下：

PCR程序如下：

用上述方法扩增出来的产物，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，确认片段的正确性并割胶回收相应的yqjH上下游同源片段。

与此同时，用质粒提取试剂盒(生工生物)提取pYG4质粒，并使用下面的酶切体系进行酶切：

上述酶切体系中使用的BglII购买自宝日医生物技术(北京)有限公司，同时，将混匀的上述体系放入37℃培养箱孵育15min，然后，使用胶回收试剂盒(Omega)对酶切后的载体片段进行回收。

将酶切并割胶回收的pYG4质粒载体片段和yqjH基因上下游同源臂片段，按照一步无缝连接试剂盒

将上述体系混合好以后，放置于50℃水浴中15min，然后至于冰上终止反应，吸取10μl全部的连接反应液，热激法转化大肠杆菌S17-1(42℃水浴热激90s)，摇床恢复培养1h以后，涂布Kana平板，并放置于37℃培养箱过夜培养，待长出单菌落以后，挑取单菌落并用引物yqjH-QJ-F和yqjH-QJ-R鉴定转化成功的转化子(扩增出来的片段长度是：580bp，其序列如SEQ ID NO.11所示)，则证明敲除载体pYG4-yqjH构建正确，可用于后续实验。

所述的引物序列如下：

yqjH-QJ-F：AGCCTTCGTGTTGGTGCTCTGT(SEQ ID NO.8)，

yqjH-QJ-R：CAAAGTGTGCCGGACAATTCAG(SEQ ID NO.9)。

二、接合转移和yqjH敲除子鉴定

将携带有敲除载体pYG4-yqjH的大肠杆菌S17-1与魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8野生菌进行接合转移。具体来说，就是先将上述两株菌分别过夜培养，然后调节OD

将一次交换重组成功的菌株用LB液体培养基扩大培养，用扩大培养菌液适当稀释后在含质量分数5％蔗糖的LB平板上划线，培养72h后，挑取平板上的单菌落用引物yqjH-QJ-F和yqjH-QJ-R进行PCR验证(图1，泳道4)，确定yqjH敲除菌，敲除菌株应该是发生了双交换，所以只能扩增出小条带，即580bp条带(其序列如SEQ ID NO.11所示)；将PCR鉴定为阳性的菌落分别在含50mg/L Kana LB平板和含50mg/L利福平LB平板上划线，具有利福平抗性、对Kana敏感菌株为最终的yqjH基因敲除菌ΔyqjH，用于后续实验。

将yqjH基因敲除菌ΔyqjH命名为Citrobacter werkmaniiΔyqjH，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址是：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59栋5楼，邮编：510070，保藏号为GDMCC No：62255，保藏日期为：2022年2月18日。

实施例2 yqjH敲除子生物被膜形成能力测定

分别使用3种不同的培养基：普通LB培养基、营养肉汤培养基(NB)和胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)和3种温度条件(25℃、30℃和37℃)测定ΔyqjH的生物被膜形成能力，其实验步骤主要是：分别用LB、NB和TSB过夜培养ΔyqjH和野生魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8，第二天将菌液的浓度分别用新鲜的LB、NB和TSB调节到OD

魏氏柠檬酸杆菌野生菌株GDFMZ BF-8和yqjH基因敲除子ΔyqjH在不同条件下的生物被膜形成能力见图2，与魏氏柠檬酸杆菌野生菌株GDFMZ BF-8相比，ΔyqjH在不同条件下的生物被膜形成能力提高的倍数如下表所示：

从图2和上表可以看出，温度较高的时候(37℃)，魏氏柠檬酸杆菌野生菌株GDFMZBF-8在静置条件下，可以形成较多的生物被膜(图2C)，但在温度较低的时候(25℃和30℃)，野生菌株BF-8生物被膜形成量较少(图2A和2B)；但在25℃和30℃条件下，在LB培养基中，静置培养，其ΔyqjH的生物被膜形成能力提高分别提高了1.97和1.47倍；而对于NB培养基，其ΔyqjH形成生物被膜的最佳条件是30℃静置培养(提高4.20倍)；对于TSB培养基，其ΔyqjH形成生物被膜的最佳条件是25℃静置培养(提高2.33倍)；综上所述，若想获得比魏氏柠檬酸杆菌野生菌株GDFMZ BF-8更多的生物被膜，其最佳的培养条件是聚苯烯附着材料、NB培养基、30℃和静置培养。

上述结果说明，可以通过敲除魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因实现该菌株生物被膜生物量的提高，具备实际应用潜力和前景。

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 一种魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因敲除突变株及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 774

<212> DNA

<213> 魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8(Citrobacter werkmanii GDFMZ BF-8)

<400> 1

atgacaaaaa acacctcacg ctaccctcag cgcgttcgca atgaactgcg cttccgtgaa 60

cttactgtcc tgcgcgtaga acgtattagc gcgggttttc agcgcatcgt actgggcggt 120

gacgcgctgg acggttttag ctcgcacggt tttgatgacc ataccaaggt ctttttcccg 180

gagccgggca gccattttgt gccgcctgtt gtcaccgatg aaggcattgt ctgggctgac 240

ggcgtacgtc cgctctcccg tgactacacg ccgttgtatg acgaagcgcg ccatgagctg 300

gcactggatt tttatattca tgacggtggc gtggcgagca catgggcgat gaatgctcgc 360

gagggtgaca agctgacgat cggtggtccg cgcggttctt tggtggtgcc agaggattat 420

gcgtatcagg tttacgtgtg tgatgaatca ggaatgcccg cgctgcgccg acggctggag 480

tcgctcagcc gtttagcggt acgcccgaac gtaacggcgc tggtaaacgt gcaggatgcg 540

gcgtatcagg actattttgc ccatctcgac gagtttacta ttcagtggtt tatcggccat 600

gacgaacagg tggtgaacga acatttatcg cggctgaacg tgcccgcaga cgattatttc 660

atctggatta ccggcgaagg caaggcggta aaaaacctca gcgttcgctt tgaaaccgag 720

gcgttcgatc agcaactggt gcgcgcaacg gcttactggc atcaacgccg ttaa 774

<210> 2

<211> 1155

<212> DNA

<213> 魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8(Citrobacter werkmanii GDFMZ BF-8)

<400> 2

atcgcccaaa tcagccactc aacgctggaa cagtccgatg gtctttccag cctgactcgt 60

gcggtgaatg aattgagcag catcacgcag aaaaacgccg aactggttga agagagtgcc 120

cagatttccg cgatggtgaa acatcgcgcg ggtcgtctgg aagatgcggt cacggtgctg 180

cattaatctt aaccacagca ggcgcaacgc cggacacggg ttccgcctgc tgcgcagatt 240

aatctaactg cgtaatatcc agtgcggcgc gatcgataat accaatgatt tttttgatct 300

gcgcctcgct ggtatcacca tgattgacgc gtaggtccag cacagctttg aagttctcca 360

gcgcgcgttt catctgtgga tttttacgta attcaaaacc cacacagcgg gctttaatac 420

gttcgtggat atgttccaga tgttcgcggt tctcatccag ccactgcaga ccttgagtcg 480

tgatggcaat ttgcttacgc ccgccttcct cgtcgctgat ggcgatcagg gcctgatcct 540

gcaacagatc cagcgtcgga tagataacgc cagggctcgg ggtgtagtta ccctgggtca 600

gggtttcaat cgctttaatc agttcatagc cgtggctggc gtcgcgggtc aggatatcca 660

gaatcaccag gcgtaattcg ccgtgaccga agaagcgctg gcgacgacca ccacctccgc 720

cgcgaccgtg gcggcgtccg caaccctgtt cgtggtgatg ttcctggtga cagcctgcgt 780

ggcgatgctc ttcacttttg cagcagcctg catggtgctc actgtggcgg ctttcgtggt 840

gatgtccttc acccttgcag cagccttcgt gttggtgctc tgtatgttta cagcaacctt 900

catgatggtt ttgcatcatc gtctcctgat gttatttaga tatatctaat ttatatctaa 960

attttatcag cttgcaagtc tataagatga tttttgttta atttgatgat ttttaatggt 1020

ttttatgggt tgctgatagc tgtttaatca caagctgact atatcaaaaa agtgcttgca 1080

atctttttga ttagcaatca ttatcattta aaaataaatt tagatatatc gtattatctt 1140

cacgaaggcg aaaaa 1155

<210> 3

<211> 831

<212> DNA

<213> 魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8(Citrobacter werkmanii GDFMZ BF-8)

<400> 3

tcagtaattc gatggcggca cgccaaacgc ctggcgaaat gcatagctaa atgccgcggt 60

gctggaatac cccacatcca gcgccacagt ggttatgctt ttatttttct tcagcattaa 120

taccgattcc agaatacgca ttttttgctt ccagacgctg aagggcaatc cggtttcttt 180

tttgaaatgg cgtgaaaagg tacgggctga catgcccaga tgctgtgccc agtattcaac 240

cgaatgctcc agggccgggg attcctgaat tgtccggcac actttggtta attcgcgatc 300

gtgtggccag ggtaatacaa aagcgacttc cgggagctgc agaataatat cgaccagaac 360

actaaccagc ttaccctctt ttgactggct atcataatgg cccgaaatta aattggtggc 420

gtaatgaata aactctctgg cgaaatcact gatcgccacc actttacatt cattgatgct 480

ctcttcaaga aaacccggct taatatccag attctctaaa tacacatcat ccagtgccca 540

gaccgcatgc tcggtattat tggggatcca gatgccataa tgcgctggaa ttatccagca 600

tttgccggcg acatcaattc gcatgctgcc tttacgggcg aaatgaaact gcataaaaga 660

gtgcgaatgc agcggaacat gatggttggc ttccaggaca taagaacgga agtacacgtc 720

ctgcggtagc tccgtaatgg agttatcggg aaatgaattc cactgttttt gcgcgagagt 780

ctccataaat aaatcgtcaa tgctcccggt gatgtgtccg ctattcgata g 831

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaagtgcca cctgcagatc tatcgcccaa atcagccact 40

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccgccatcg aattactgat ttttcgcctt cgtgaagata at 42

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcagtaatt cgatggcggc a 21

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agtcatatgc cgcggagatc tctatcgaat agcggacaca tcacc 45

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agccttcgtg ttggtgctct gt 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caaagtgtgc cggacaattc ag 22

<210> 10

<211> 5796

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca tctccttgct gcctcgcgcg tttcggtgat 60

gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 120

gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 180

gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat 240

cagagcagat tgtactgaga gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 300

cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 360

acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 420

ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 480

tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgcagatctc cgcggcatat gactagtgcg 540

gccgcgttgt gtctcaaaat ctctgatgtt acattgcaca agataaaaat atatcatcat 600

gaacaataaa actgtctgct tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc 660

aacgggaaac gtcttgctcg aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg 720

ggtataaatg ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg 780

ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg 840

ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca 900

agcattttat ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccgggaaaa 960

cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg 1020

cagtgttcct gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc 1080

gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa caatttggtt gatgcgagtg 1140

attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataagc 1200

tgcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 1260

ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 1320

accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 1380

agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg atggtcctga tatgaataaa ttgcagtttc 1440

atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga 1500

gcattacgct gacttgacgg gacggcggct ttgttgaata aatcgaactt ttgctgagtt 1560

gaaggatcag atcacgcatc ttcccgacaa cgcagaccgt tccgtggcaa agcaaaagtt 1620

caaaatcacc aactggtcca cctacaacaa agctctcatc aaccgtggct ccctcacttt 1680

ctggctggat gatggggcga ttcaggcctg gtatgagtca gcaacacctt cttcacgagg 1740

cagacctcag cgcgagctcg gccgcctagg ccgggccctc tagagaattc ttaattaacc 1800

cacgtgttga gaaataaaag aaaatgccaa tgaagtatcg gcattttctt tttgctgtta 1860

ttagttgact gtcagctgtc cttgctccag gatgctgttt ttgacaacgg atgttttatt 1920

gcctttgatg ttcattaaga agctcggggc aaatgttgcc tttttatcct cgaagaagcc 1980

tctgtttgtc atgtagcttg tgataaccac attgttgcct ttggcttgcg gcactgcgaa 2040

gtgagagtaa gtgaatgtca catcgtttgg atcaagaccc atttgcagca caagccctgt 2100

tttgttcagc ggcttgtaag ggccggttaa agagtttgat acataaccaa gcatgtaaat 2160

atcgtttgag ttaataccat cgatcgtcat ttttgaaccg cgtgaatcag tgaacaagta 2220

ccatttgccg ttcattttga aaacattcgc gcgctcgatt tcatcagtta ccgtgtttga 2280

agtgatcagc ggcttcatta cttttttcaa tgtgtaatca ttattaactc tatgataccg 2340

agggcgccgt tcgctaactc agcatcgcgt tttttagcgc tctgctggag cttctggctt 2400

tctttacgga agaagttcgt gccgccgccg tagtacgctt tgttaaataa agattcttcg 2460

ccttggtatc cgttttctgt tcccgtgttg gcttcgaata caagatattt atggcctttg 2520

tcttcaacgt agtgagggtc tctcagcgta tggttgtcgc cggatgtata attgccttca 2580

tcgataaact gctgaacgtt ctgatatgtt tttccgtctc cgtcaaaaat cgttttgtga 2640

tcttccactc cgttgatttt gagtgtgtca tcagattttg acacatttac ctgcgctgtt 2700

gtcaggcttt gtttgccgta atgtttaccg gaatagtcag tgtagaataa acggattttt 2760

ccgtcagatg taaaggttgc agaaccggac cattcttgcg tctgatcttt caggatcgga 2820

tcgttggcgt cgaacttatc gctgtcttta aagacacggc ccgcgttttt ccagctgtcg 2880

attgagttgt cgccgacctt ttgataaaac atgtagattg atgtgtcatc agcgtctttc 2940

gggcttcccg caagagcaaa cacaacgtga tagccgttgt attcagctac tgttccgtca 3000

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aaattgcttt gagaggctct aagggcttct cagtgcgtta catccctggc ttgttgtcca 3600

caaccgttaa accttaaaag ctttaaaagc cttatatatt cttttttttc ttataaaact 3660

taaaacctta gaggctattt aagttgctga tttatattaa ttttattgtt caaacatgag 3720

agcttagtac gtgaaacatg agagcttagt acgttagcca tgagagctta gtacgttagc 3780

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gtgaaacatg agagcttagt acgtactatc aacaggttga actgctgatc ttcagatcct 3900

ctacgccgga cgcatcgtgg ccggatccag ccgaccaggc tttccacgcc cgcgtgccgc 3960

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agcccgtagt cccgttcgag cgtcgcgcag aggtcagcga gggcgcggta ggcccgatac 4080

ggctcatgga tggtgtttcg ggtcgggtga atcttgttga tggcgatatg gatgtgcagg 4140

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cccaggcgct cggtcttgcc ttgctcgtcg gtgatgtact tcaccagctc cgcgaagtcg 4440

ctcttcttga tggagcgcat ggggacgtgc ttggcaatca cgcgcacccc ccggccgttt 4500

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caaaaaggat cctctacgcc ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg 5700

ttgctggcgc ctatctcgcc gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc 5760

tcatgagcgc ttgtttcggc gtgggtatgg tggcag 5796

<210> 11

<211> 580

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agccttcgtg ttggtgctct gtatgtttac agcaaccttc atgatggttt tgcatcatcg 60

tctcctgatg ttatttagat atatctaatt tatatctaaa ttttatcagc ttgcaagtct 120

ataagatgat ttttgtttaa tttgatgatt tttaatggtt tttatgggtt gctgatagct 180

gtttaatcac aagctgacta tatcaaaaaa gtgcttgcaa tctttttgat tagcaatcat 240

tatcatttaa aaataaattt agatatatcg tattatcttc acgaaggcga aaaatcagta 300

attcgatggc ggcacgccaa acgcctggcg aaatgcatag ctaaatgccg cggtgctgga 360

ataccccaca tccagcgcca cagtggttat gcttttattt ttcttcagca ttaataccga 420

ttccagaata cgcatttttt gcttccagac gctgaagggc aatccggttt cttttttgaa 480

atggcgtgaa aaggtacggg ctgacatgcc cagatgctgt gcccagtatt caaccgaatg 540

ctccagggcc ggggattcct gaattgtccg gcacactttg 580